Biochemical and X-ray crystallographic studies on the energy transducing protein TonB and the TonB-dependent siderophore receptor FhuA from Escherichia coli

Die Zellwand gram negativer Bakterien beinhaltet viele Proteine die für den Transport lebenswichtiger Substanzen verantwortlich sind. Vor allem die Äußere der beiden Lipidmembranen erfüllt eine wichtige Schutzfunktion, die besondere Anforderungen an die Transportsysteme der äußeren Membran stellt. Die direkte Aufnahme von Eisen stellt ein besonderes Problem dar, da die Konzentration an freien Eisenionen in wässriger Lösung sehr gering ist. Bakterien haben dieses Problem durch spezifische Transportwege für eine ganze Anzahl von chemisch verschiedenen Siderophoren gelöst. Siderophore sind Moleküle von etwa 600 Da, die Eisenionen aus der Umgebung der Zelle komplexieren und zum Teil von den Bakterien selbst synthetisiert und sekretiert werden. Eines dieser Siderophore ist Ferrichrome das pilzlichen Ursprungs ist und in Escherichia coli durch das Transportprotein FhuA (ferric hydroxamate uptake system) über die äußere Membran ins Periplasma aufgenommen wird. Einige Phagen wie T1, T5, 80 und UC-1 nutzen FhuA als Bindeprotein an E. coli. Auf der anderen Seite stellt FhuA auch einen wichtigen Aufnahmeweg für einige Antibiotika dar, wie für das chemisch dem Ferrichrom verwandte Albomyzin oder für das strukturell ganz anders aussehende Rifamycin Derivat CGP 4832. Die Energie, die für diese spezifische Aufnahme durch FhuA gebraucht wird, stammt von der chemischen Potentialdifferenz an der inneren Bakterienmembran, hervorgerufen durch einen H+-Konzentrationsradienten. Die Übertragung der Energie von der inneren Membran auf FhuA erfolgt durch den Proteinkomplex ExbB/ExbD/TonB. Alle drei Proteine sind in der inneren Membran verankert, wobei der größte Teil von TonB ins Periplasma ragt und mit seiner C-terminalen Domaine den eigentlichen Kontakt zu FhuA herstellt. Da TonB eine große Anzahl homologer Außenmembran-Transporter mit der nötigen Energie versorgt, wird diese Klasse von Proteinen, im Gegensatz zu den ABC-Transportern, als TonB-abhängige Transporter bezeichnet.<br />Die dreidimensionalen Röntgenstrukturen von einigen TonB-abhängigen Transportproteinen sind mittlerweile bekannt. Für die vorliegende Arbeit ist die Struktur von FhuA (Ferguson et al., 1998, Science, 282, 2215) von besonderer Bedeutung. Ebenfalls bekannt sind einige Strukturen von FhuA mit verschiedenen Liganden wie Ferrichrome, Phenylferrichrome, Albomyzin und Rifamyzin CGP 4832. Die Strukturlösung des FhuA-CGP 4832 Komplexes ist Teil der vorliegenden Arbeit.<br />TonB, das aus 239 Aminosäuren besteht, wurde erstmals nur als Fragment der letzten 85 C-terminalen Aminosäuren kristallisiert (Chang et al., 2001, JBC, 276, 27535). Dieses TonB-85 Fragment zeigt ein Homodimer, dessen funktionelle Rolle im Prozess der Energieübertragung unbekannt blieb.<br />Im Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedlich lange C-terminale Fragmente von TonB aus E. coli überexprimiert und gereinigt, bestehend aus 77, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 106, 116 und 126 Aminosäuren. Die Kristallisation und Strukturanalyse konnte für zwei TonB Fragmente erfolgreich durchgeführt werden: TonB-77 zeigt eine Dimerenstruktur, identisch mit der von TonB-85. TonB-92 bildet dagegen eine signifikant andere Struktur. Diese unterschiedlichen Strukturen sind im Einklang mit dem Verhalten dieser Fragmente in Lösung: Die kürzeren Fragmente liegen als Dimere und die längeren Fragmente als Monomere vor. Für ein weiteres Verständnis der FhuA-TonB Wechselwirkung wurde die Fähigkeit der TonB Fragmente untersucht, in vitro an FhuA zu binden. Es stellte sich heraus, daß die gleichen Fragmente, die in der Lage sind FhuA zu binden, auch die Ferrichromaufnahme in vivo blockieren und die Zellen vor dem Angriff durch Bakteriophagen phi80 schützen.

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