Mammalian Diacylglycerol Kinase Epsilon: Expression in Sf21 Cells, Purification, and Characterization
Notice bibliographique
Résumé
This is the first report of the purification and characterization of the arachidonoyl‐specific diacylglycerol kinase epsilon (DGKε). We have purified human DGKε and a truncated form lacking the first 40 residues (DGKεΔ40) to near homogeneity using Nickel‐affinity chromatography. Enzyme activity measurements showed that both purified constructs retained their substrate acyl chain specificity and have a specific activity comparable to N‐terminally FLAG epitope tagged forms of these proteins expressed in Cos‐7 cells. Thus, it is unlikely that the activity of DGKε is dependent on components present in cruder preparations. We observed that purified DGKε activity is lost rapidly and that freeze thawing is particularly damaging. We show that storage in 50% glycerol stabilizes DGKε significantly at 4°C, ‐80 °C and during freeze thawing. Secondary structure analyses using circular dichroism revealed that DGKε contains both α‐helical (~19%) and β‐structure (~25%), in agreement with predictive algorithms. DGKε exhibited a gradual and irreversible loss of secondary structure on heating to 100°C with slight stabilization upon adding dioleoyl‐phosphatidylcholine (DOPC). In contrast, DGKεΔ40 retained less structure at 100°C and showed a cooperative denaturation at about 80 o C with DOPC present. Interestingly, atomic force microscopy shows that DGKεΔ40 forms smaller and fewer aggregates on mica and on supported lipid bilayers (SLBs) compared to DGKε, despite both forms displaying similar activity trends. Aggregation on SLBs was reduced by the addition of a preferred substrate. This study provides the first successful purification of DGKε and a partial characterization of its enzymatic and conformational properties.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».