Cell‐free protein synthesis and purification of human dopamine D2 receptor long isoform
Notice bibliographique
Résumé
The human dopamine D2 receptor long isoform (D2L) has significant implications in neurological and neuropsychiatric disorders such as Parkinson's disease and schizophrenia. Detailed structural knowledge of this receptor is limited owing to its highly hydrophobic nature, which leads to protein aggregation and host toxicity when expressed in cellular systems. The newly emerging field of cell-free protein expression presents numerous advantages to overcome these challenges. This system utilizes protein synthesis machinery and exogenous DNA to synthesize functional proteins outside of intact cells. This study utilizes two different cell-free systems for the synthesis of human dopamine D2L receptor. These include the Escherichia coli lysate-based system and the wheat-germ lysate-based system. The bacterial cell-free method used pET 100/D-TOPO vector to synthesize hexa-histidine-tagged D2L receptor using a dialysis bag system; the resulting protein was purified using nickel-nitrilotriacetic acid affinity resin. The wheat germ system used pEU-glutathione-S-transferase (GST) vector to synthesize GST-tagged D2L receptor using a bilayer translation method; the resulting protein was purified using a GST affinity resin. The presence and binding capacity of the synthesized D2L receptor was confirmed by immunoblotting and radioligand competition assays, respectively. Additionally, in-gel protein sequencing via Nano LC-MS/MS was used to confirm protein synthesis via the wheat germ system. The results showed both systems to synthesize microgram quantities of the receptor. Improved expression of this highly challenging protein can improve research and understanding of the human dopamine D2L receptor.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
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Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».