Modification of the Creator recombination system for proteomics applications – improved expression by addition of splice sites
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Recombinational systems have been developed to rapidly shuttle Open Reading Frames (ORFs) into multiple expression vectors in order to analyze the large number of cDNAs available in the post-genomic era. In the Creator system, an ORF introduced into a donor vector can be transferred with Cre recombinase to a library of acceptor vectors optimized for different applications. Usability of the Creator system is impacted by the ability to easily manipulate DNA, the number of acceptor vectors for downstream applications, and the level of protein expression from Creator vectors. RESULTS: To date, we have developed over 20 novel acceptor vectors that employ a variety of promoters and epitope tags commonly employed for proteomics applications and gene function analysis. We also made several enhancements to the donor vectors including addition of different multiple cloning sites to allow shuttling from pre-existing vectors and introduction of the lacZ alpha reporter gene to allow for selection. Importantly, in order to ameliorate any effects on protein expression of the loxP site between a 5' tag and ORF, we introduced a splicing event into our expression vectors. The message produced from the resulting 'Creator Splice' vector undergoes splicing in mammalian systems to remove the loxP site. Upon analysis of our Creator Splice constructs, we discovered that protein expression levels were also significantly increased. CONCLUSION: The development of new donor and acceptor vectors has increased versatility during the cloning process and made this system compatible with a wider variety of downstream applications. The modifications introduced in our Creator Splice system were designed to remove extraneous sequences due to recombination but also aided in downstream analysis by increasing protein expression levels. As a result, we can now employ epitope tags that are detected less efficiently and reduce our assay scale to allow for higher throughput. The Creator Splice system appears to be an extremely useful tool for proteomics.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».