Defining the Q<sub>P</sub>‐site of <i>Escherichia coli</i> fumarate reductase by site‐directed mutagenesis, fluorescence quench titrations and EPR spectroscopy
Notice bibliographique
Résumé
We have used fluorescence quench titrations, EPR spectroscopy and steady-state kinetics to study the effects of site-directed mutants of FrdB, FrdC and FrdD on the proximal menaquinol (MQH(2)) binding site (Q(P)) of Escherichia coli fumarate reductase (FrdABCD) in cytoplasmic membrane preparations. Fluorescence quench (FQ) titrations with the fluorophore and MQH(2) analog 2-n-heptyl-4-hydroxyquinoline-N-oxide (HOQNO) indicate that the Q(P) site is defined by residues from FrdB, FrdC and FrdD. In FQ titrations, wild-type FrdABCD binds HOQNO with an apparent K(d) of 2.5 nM, and the following mutations significantly increase this value: FrdB-T205H (K(d) = 39 nM); FrdB-V207C (K(d) = 20 nM); FrdC-E29L (K(d) = 25 nM); FrdC-W86R (no detectable binding); and FrdD-H80K (K(d) = 20 nM). In all titrations performed, data were fitted to a monophasic binding equation, indicating that no additional high-affinity HOQNO binding sites exist in FrdABCD. In all cases where HOQNO binding is detectable by FQ titration, it can also be observed by EPR spectroscopy. Steady-state kinetic studies of fumarate-dependent quinol oxidation indicate that there is a correlation between effects on HOQNO binding and effects on the observed K(m) and k(cat) values, except in the FrdC-E29L mutant, in which HOQNO binding is observed, but no enzyme turnover is detected. In this case, EPR studies indicate that the lack of activity arises because the enzyme can only remove one electron from reduced MQH(2), resulting in it being trapped in a form with a bound menasemiquinone radical anion. Overall, the data support a model for FrdABCD in which there is a single redox-active and dissociable Q-site.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».