Detection of Intermediates from the Polymerization Reaction Catalyzed by a D302A Mutant of Class III Polyhydroxyalkanoate (PHA) Synthase
Notice bibliographique
Résumé
Polyhydroxybutyrate (PHB) synthases catalyze the polymerization of (R)-3-hydroxybutyryl-CoA (HB-CoA) into high molecular weight PHB, biodegradable polymers. The class III PHB synthase from Allochromatium vinosum is composed of a 1:1 mixture of two approximately 40 kDa proteins: PhaC and PhaE. Previous studies using site-directed mutagenesis and a saturated trimer of hydroxybutyryl-CoA have suggested the importance of C149 (in covalent catalysis), H331 (in activation of C149), and D302 (in hydroxyl group activation for ester bond formation) in the polymerization process. All three residues are located on PhaC. We now report that incubation of D302A-PhaCPhaE with [14C]-HB-CoA results in detection, for the first time, of oligomeric HBs covalently bound to PhaC. The reaction products have been analyzed by SDS-PAGE, Westerns with PhaCPhaE antibodies, and autoradiography. Different migratory properties of D302A-PhaC on SDS-PAGE have been observed at [14C]-HB-CoA to enzyme (S/E) ratios between 5 and 100. Trypsin digestion and HPLC analysis of the D302A-PhaCPhaE (from a reaction with a S/E ratio of 5) allowed isolation of multiple radiolabeled peptides. N-Terminal sequencing, MALDI-TOF, and ESI mass spectrometric analysis of these peptides revealed that all of the peptides were identical but were modified by (HB)n ranging in size from n = 3 to n = 10. The in vitro results support the role of D302 in elongation rather than in activating the active site cysteine for acylation. This proposal has been further supported by our in vivo studies on a Wautersia eutropha strain in which the class I synthase gene has been replaced with the D302A-PhaCPhaE gene and the organism examined under PHB production conditions by transmission electron microscopy. Very small granules (<0.05 microm) were observed in contrast to the 0.2-0.5 microm granules observed with the wt strain. Use of the D302A synthase has allowed successful interrogation of the initiation and elongation steps catalyzed by the class III synthase.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».