Structure-Guided Design of an Engineered Streptavidin with Reusability to Purify Streptavidin-Binding Peptide Tagged Proteins or Biotinylated Proteins
Notice bibliographique
Résumé
Development of a high-affinity streptavidin-binding peptide (SBP) tag allows the tagged recombinant proteins to be affinity purified using the streptavidin matrix without the need of biotinylation. The major limitation of this powerful technology is the requirement to use biotin to elute the SBP-tagged proteins from the streptavidin matrix. Tight biotin binding by streptavidin essentially allows the matrix to be used only once. To address this problem, differences in interactions of biotin and SBP with streptavidin were explored. Loop3-4 which serves as a mobile lid for the biotin binding pocket in streptavidin is in the closed state with biotin binding. In contrast, this loop is in the open state with SBP binding. Replacement of glycine-48 with a bulkier residue (threonine) in this loop selectively reduces the biotin binding affinity (Kd) from 4 × 10(-14) M to 4.45 × 10(-10) M without affecting the SBP binding affinity. Introduction of a second mutation (S27A) to the first mutein (G48T) results in the development of a novel engineered streptavidin SAVSBPM18 which could be recombinantly produced in the functional form from Bacillus subtilis via secretion. To form an intact binding pocket for tight binding of SBP, two diagonally oriented subunits in a tetrameric streptavidin are required. It is vital for SAVSBPM18 to be stably in the tetrameric state in solution. This was confirmed using an HPLC/Laser light scattering system. SAVSBPM18 retains high binding affinity to SBP but has reversible biotin binding capability. The SAVSBPM18 matrix can be applied to affinity purify SBP-tagged proteins or biotinylated molecules to homogeneity with high recovery in a reusable manner. A mild washing step is sufficient to regenerate the matrix which can be reused for multiple rounds. Other applications including development of automated protein purification systems, lab-on-a-chip micro-devices, reusable biosensors, bioreactors and microarrays, and strippable detection agents for various blots are possible.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».