Probing the Origins of Spectroscopic Responses to Analyte-Induced Conformational Changes in Fluorescently-Labeled Cod III Parvalbumin
Notice bibliographique
Résumé
An emerging strategy for the development of reagentless biosensors is the coupling of fluorescence responses to analyte-induced conformational changes within fluorescently-labeled proteins. In this work, we have examined the absorbance and the steady-state and time-resolved fluorescence responses to Ca 2+ -induced conformational changes within cod III parvalbumin (C3P), which was labeled at cysteine-18 with the fluorescent probes fluorescein, acrylodan or nitrobenzoxadiazole (NBD). The basis of the analyte-induced responses was further characterized by examining reporter group accessibility and rotational reorientation dynamics in the presence and absence of analyte. We show that the fluorescence responses are often based on a combination of direct and indirect effects, and that changes in fluorescence quantum yield can be reinforced or opposed by simultaneous changes in absorbance, dramatically affecting the sensitivity of the observed signal to analyte concentration. In the case of NBD, the response is fully consistent with an increase in the nonradiative rate constant owing to increased exposure of the reporter group to solvent as a result of the analyte-induced conformational change. However, in the case of acrylodan and fluorescein, the response reflects a specific interaction between the probe and either the added Ca 2+ or the amino acid residues in the vicinity of Cys-18, which changes in response to protein conformation. Overall, the best performance is obtained from the NBD-labeled C3P, where a signal change of almost 50% was obtained upon complete binding of Ca 2+, providing a detection limit of 100 nM, a dynamic range of 2 orders of magnitude. The other two probes produced poor responses (<10% total change in intensity on binding Ca 2+ ), highlighting the difficulty associated with predicting the behavior of a labeled protein, and showing the complexity that exists at present in the design of sensitive biosensors based on labeled regulatory proteins.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».