Determination of the exact copy numbers of particular mRNAs in a single cell by quantitative real-time RT-PCR
Notice bibliographique
Résumé
Gene expression is differently regulated in every cell even though the cells are included in the same tissue. For this reason, we need to measure the amount of mRNAs in a single cell to understand transcription mechanism better. However, there are no accurate, rapid and appropriate methods to determine the exact copy numbers of particular mRNAs in a single cell. We therefore developed a procedure for isolating a single, identifiable cell and determining the exact copy numbers of mRNAs within it. We first isolated the cerebral giant cell of the pond snail Lymnaea stagnalis as this neuron plays a key role in the process of memory consolidation of a learned behavior brought about by associative learning of feeding behavior. We then determined the copy numbers of mRNAs for the cyclic AMP-responsive element binding proteins (CREBs). These transcription factors play an important role in memory formation across animal species. The protocol uses two techniques in concert with each other: a technique for isolating a single neuron with newly developed micromanipulators coupled to an assay of mRNAs by quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction (qRT-PCR). The molecular assay determined the mRNA copy numbers, each of which was compared with a standard curve prepared from cDNA solutions corresponding to the serially diluted solutions of Lymnaea CREB mRNA. The standard curves were linear within a range of 10 to 10(5) copies, and the intra-assay variation was within 15%. Each neuron removed from the ganglia was punctured to extract the total RNA directly and was used for the assay without further purification. Using this two-step procedure, we found that the mRNA copy number of CREB repressor (CREB2) was 30-240 in a single cerebral giant cell, whereas that of CREB activator (CREB1) was below the detection limits of the assay (< 25). These results suggest that the CREB cascade is regulated by an excess amount of CREB2 in the cerebral giant cells. Our procedure is the only quantitative analysis for elucidation of the dynamics of gene transcription in a single cell.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».