Rapid Screening for Gram-Negative and Gram-Positive Beer-Spoilage <i>Firmicutes</i> Using a Real-Time Multiplex PCR

AbstractCurrent methods for detection and identification of beer-spoilage bacteria can be time-consuming and may not encompass all beer-spoilage isolates due to targeting of specific species. As such, a rapid method that targets a broader spectrum of beer-spoilage bacteria is likely to be more efficient for initial detection of contamination. Building on our previous real-time PCR (rltPCR) that detects Firmicutes, we created a system that enables concurrent detection and differentiation of gram-negative and -positive brewery-associated Firmicutes. Our two previously described rltPCR hydrolysis probes, which are able to detect all bacteria and Firmicutes, were used in combination with a newly developed probe (GmNeg) that detects only gramnegative brewery-associated Firmicutes. In silico analysis performed to determine the specificity of the GmNeg probe predicted that the probe would detect all gram-negative brewery-associated Firmicutes. This was confirmed by rltPCR analysis of brewery-associated bacteria, with the GmNeg probe showing specificity for gram-negative Firmicutes but not for gram-positive Firmicutes or any non-Firmicutes. The sensitivity of this rltPCR system was 35 fg of DNA per reaction, corresponding to approx. 10–20 bacteria. This multiplex rltPCR will enable brewery quality control laboratories to rapidly screen for brewery-associated Firmicutes, with identification of a contaminant as either a gram-negative or -positive bacterium.RESUMENLos métodos actuales de detectión e identificatión de bacterias de deterioro de cerveza puede ser mucho tiempo y no puede abarcar todos los aislados de bacterias de deterioro de cerveza debido a la orientatión de determinadas especies. Como tal, un método rápido que se dirige a un amplio espectro de bacterias de deterioro de cerveza es probable que sea más eficiente para la detección inicial de contaminación. Basándonos en nuestra anterior en tiempo real PCR (rltPCR) que detecta Firmicutes, hemos creado un sistema que permite la detección y la diferenciación simultánea de bacterias gram-negativos y gram-positivos Firmicutes asociada con la cervecería. Nuestros dos descritos anteriormente rltPCR sondas de hidrólisis, que son capaces de detectar todas las bacterias y Firmicutes, se utiliza en combinación con una sonda de nuevo desarrollo (GmNeg) que detecta sólo gram-negativos Firmicutes asociados con la cervecería. Análisis en silico realiza para determinar la especificidad de la sonda GmNeg predijo que la sonda detecta todos los gram-negativos Firmicutes asociados con la cervecería. Esto fue confirmado por análisis rltPCR de las bacterias asociadas con la cervecería, con la sonda GmNeg muestra especificidad por gram-negativos Firmicutes pero no para gram-positivas Firmicutes o de otra índole Firmicutes. La sensibilidad de este sistema de rltPCR fue de 35 fg de ADN por reacción, que corresponde a aprox. 10–20 bacterias. Esta rltPCR múltiplex permitirá que los laboratorios de control de calidad de la cervecería a rápidamente la pantalla para Firmicutes asociada con la cervecería, con la identificación de un contaminante, ya sea como bacterias gram-negativos o gram-positivos.KeywordsBeer-spoilage organismsFirmicutesGram-negativeGram-positiveMultiplex real-time PCRRapid screeningPalabras clave: Bacterias de deterioro de cervezaFirmicutesGram-negativasGram-positivasPCR múltiplex en tiempo realRapida detección

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