Integrating titania enrichment, iTRAQ labeling, and Orbitrap CID‐HCD for global identification and quantitative analysis of phosphopeptides
Notice bibliographique
Résumé
Recent advances in MS instrumentation and progresses in phosphopeptide enrichment, in conjunction with more powerful data analysis tools, have facilitated unbiased characterization of thousands of site-specific phosphorylation events. Combined with stable isotope labeling by amino acids in cell culture metabolic labeling, these techniques have made it possible to quantitatively evaluate phosphorylation changes in various physiological states in stable cell lines. However, quantitative phosphoproteomics in primary cells and tissues remains a major technical challenge due to the lack of adequate techniques for accurate quantification. Here, we describe an integrated strategy allowing for large scale quantitative profiling of phosphopeptides in complex biological mixtures. In this technique, the mixture of proteolytic peptides was subjected to phosphopeptide enrichment using a titania affinity column, and the purified phosphopeptides were subsequently labeled with iTRAQ reagents. After further fractionation by strong-cation exchange, the peptides were analyzed by LC-MS/MS on an Orbitrap mass spectrometer, which collects CID and high-energy collisional dissociation (HCD) spectra sequentially for peptide identification and quantitation. We demonstrate that direct phosphopeptide enrichment of protein digests by titania affinity chromatography substantially improves the efficiency and reproducibility of phosphopeptide proteomic analysis and is compatible with downstream iTRAQ labeling. Conditions were optimized for HCD normalized collision energy to balance the overall peptide identification and quantitation using the relative abundances of iTRAQ reporter ions. Using this approach, we were able to identify 3557 distinct phosphopeptides from HeLa cell lysates, of which 2709 were also quantified from HCD scans.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».