Microwave-assisted acid hydrolysis of proteins combined with liquid chromatography MALDI MS/MS for protein identification
Notice bibliographique
Résumé
Simple and efficient digestion of proteins, particularly hydrophobic membrane proteins, is of significance for comprehensive proteome analysis using the bottom-up approach. We report a microwave-assisted acid hydrolysis (MAAH) method for rapid protein degradation for peptide mass mapping and tandem mass spectrometric analysis of peptides for protein identification. It uses 25% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution to dissolve or suspend proteins, followed by microwave irradiation for 10 min. This detergent-free method generates peptide mixtures that can be directly analyzed by liquid chromatography (LC) matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) mass spectrometry (MS) without the need of extensive sample cleanup. LC-MALDI MS/MS analysis of the hydrolysate from 5 microg of a model transmembrane protein, bacteriorhodopsin, resulted in almost complete sequence coverage by the peptides detected, including the identification of two posttranslational modification sites. Cleavage of peptide bonds inside all seven transmembrane domains took place, generating peptides of sizes amenable to MS/MS to determine possible sequence errors or modifications within these domains. Cleavage specificity, such as glycine residue cleavage, was observed. Terminal peptides were found to be present in relatively high abundance in the hydrolysate, particularly when low concentrations of proteins were used for MAAH. It was shown that these peptides could still be detected from MAAH of bacteriorhodopsin at a protein concentration of 1 ng/microl or 37 fmol/microl. To evaluate the general applicability of this method, it was applied to identify proteins from a membrane protein enriched fraction of cell lysates of human breast cancer cell line MCF7. With one-dimensional LC-MALDI MS/MS, a total of 119 proteins, including 41 membrane-associated or membrane proteins containing one to 12 transmembrane domains, were identified by MS/MS database searching based on matches of at least two peptides to a protein.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».