Redefining the Minimal Substrate Tolerance of Mandelate Racemase. Racemization of Trifluorolactate
Notice bibliographique
Résumé
Mandelate racemase (EC 5.1.2.2) from Pseudomonas putida catalyzes the interconversion of the enantiomers of mandelic acid and a variety of aryl- and heteroaryl-substituted mandelate derivatives, suggesting that β,γ-unsaturation is a requisite feature of substrates for the enzyme. We show that β,γ-unsaturation is not an absolute requirement for catalysis and that mandelate racemase can bind and catalyze the racemization of (S)-trifluorolactate (k(cat) = 2.5 ± 0.3 s(-1), K(m) = 1.74 ± 0.08 mM) and (R)-trifluorolactate (k(cat) = 2.0 ± 0.2 s(-1), K(m) = 1.2 ± 0.2 mM). The enzyme was shown to catalyze hydrogen-deuterium exchange at the α-postion of trifluorolactate using (1)H NMR spectrocsopy. β-Elimination of fluoride was not detected using (19)F NMR spectroscopy. Although mandelate racemase bound trifluorolactate with an affinity similar to that exhibited for mandelate, the turnover numbers (k(cat)) were markedly reduced by ∼318-fold, resulting in catalytic efficiencies (k(cat)/K(m)) that were ~400-fold lower than those observed for mandelate. These observations suggested that chemical steps on the enzyme were likely rate-determining, which was confirmed by demonstrating that the rates of mandelate racemase-catalyzed racemization of (S)-trifluorolactate were not dependent upon the solvent microviscosity. Circular dichroism spectroscopy was used to measure the rates of nonenzymatic racemization of (S)-trifluorolactate at elevated temperatures. The values of ΔH(‡) and ΔS(‡) for the nonenzymatic racemization reaction were determined to be 28.0 (±0.7) kcal/mol and -15.7 (±1.7) cal K(-1) mol(-1), respectively, corresponding to a free energy of activation equal to 33 (±4) kcal/mol at 25 °C. Hence, mandelate racemase stabilizes the altered trifluorolactate in the transition state (ΔG(tx)) by at least 20 kcal/mol.
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Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
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score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».