Flow cytometry and GFP: A novel assay for measuring the import and turnover of nuclear‐encoded mitochondrial proteins in live PC12 cells
Pourquoi ce travail est dans la base
Une base qui oublie comment elle a trouvé un travail ne peut pas être vérifiée. Voici les voies qui ont admis celui-ci.
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Mitochondrial protein import is typically measured by adding radiolabeled precursor proteins to isolated mitochondria. We have developed a novel, high-throughput method for measuring protein import in live differentiated PC12 cells using a tetracycline (Tet) regulated, nuclear encoded, mitochondrially-targeted GFP fusion protein and flow cytometry. METHODS: We generated a PC12 cell line stably transfected with an inducible GFP fusion protein (GFPmt) targeted to mitochondria. GFPmt PC12 cells were treated with NGF for one week to induce neuronal differentiation in the presence of Tet to silence GFP expression. On day seven GFPmt expression was induced by removal of Tet and these "GFP-on" cells were exposed to sublethal levels of CCCP (2 microM) for 24 h. At 24 h, the cells were harvested in Ca(++)-free PBS and the GFPmt signal in live intact cells was measured using flow cytometry. Since GFPmt is not fluorescent prior to being imported into mitochondria, the GFPmt signal reflected only GFPmt imported to mitochondria. PI was used to gate out contributions from dead cells. Turnover of GFPmt in mitochondria was also assessed; in this case, Tet was added to arrest GFPmt expression in GFP-on cells, and the subsequent decline of the fluorescent signal, in the absence of any new GFP synthesis, was measured by flow cytometry. RESULTS: Exposure to 2 microM CCCP for 24 h caused a 61% +/- 0.4 decline in GFPmt fluorescence compared to controls. This decline corresponded to a 30% +/- 7 decrease in GFPmt protein levels measured by Western blot of mitochondrial fractions, and a 72% +/- 5 decline in the import of newly synthesized GFPmt to mitochondria over a 1 h period 24-h after addition of 2 microM CCCP measured by autoradiography. CCCP partially depolarized mitochondria but was not lethal for up to five days. CONCLUSIONS: This novel GFP-based flow cytometry assay is a rapid and sensitive technique for quantifying protein import to mitochondria in live neuronal cells.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découle