Flow cytometry and GFP: A novel assay for measuring the import and turnover of nuclear‐encoded mitochondrial proteins in live PC12 cells
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Mitochondrial protein import is typically measured by adding radiolabeled precursor proteins to isolated mitochondria. We have developed a novel, high-throughput method for measuring protein import in live differentiated PC12 cells using a tetracycline (Tet) regulated, nuclear encoded, mitochondrially-targeted GFP fusion protein and flow cytometry. METHODS: We generated a PC12 cell line stably transfected with an inducible GFP fusion protein (GFPmt) targeted to mitochondria. GFPmt PC12 cells were treated with NGF for one week to induce neuronal differentiation in the presence of Tet to silence GFP expression. On day seven GFPmt expression was induced by removal of Tet and these "GFP-on" cells were exposed to sublethal levels of CCCP (2 microM) for 24 h. At 24 h, the cells were harvested in Ca(++)-free PBS and the GFPmt signal in live intact cells was measured using flow cytometry. Since GFPmt is not fluorescent prior to being imported into mitochondria, the GFPmt signal reflected only GFPmt imported to mitochondria. PI was used to gate out contributions from dead cells. Turnover of GFPmt in mitochondria was also assessed; in this case, Tet was added to arrest GFPmt expression in GFP-on cells, and the subsequent decline of the fluorescent signal, in the absence of any new GFP synthesis, was measured by flow cytometry. RESULTS: Exposure to 2 microM CCCP for 24 h caused a 61% +/- 0.4 decline in GFPmt fluorescence compared to controls. This decline corresponded to a 30% +/- 7 decrease in GFPmt protein levels measured by Western blot of mitochondrial fractions, and a 72% +/- 5 decline in the import of newly synthesized GFPmt to mitochondria over a 1 h period 24-h after addition of 2 microM CCCP measured by autoradiography. CCCP partially depolarized mitochondria but was not lethal for up to five days. CONCLUSIONS: This novel GFP-based flow cytometry assay is a rapid and sensitive technique for quantifying protein import to mitochondria in live neuronal cells.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,003 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,003 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,003 | 0,004 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,004 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».