Cloning, Expression, Characterization, and Nucleophile Identification of Family 3, Aspergillus nigerβ-Glucosidase
Notice bibliographique
Résumé
The beta-glucosidase from Aspergillus niger (CMI CC 324262) was purified, and an N-terminal sequence and two internal sequences were determined. BglI genomic gene and the cDNA were cloned from a genomic library and by reverse transcriptase-polymerase chain reaction, respectively. The cDNA was successfully expressed in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. Sequence analysis revealed that the gene encodes a 92-kDa enzyme that is a member of glycosidase family 3. (1)H-NMR analysis of the reaction catalyzed by this enzyme confirmed that, in common with other family 3 glycosidases, this enzyme hydrolyzes with net retention of anomeric configuration. Accordingly, the enzyme was inactivated by 2-deoxy-2-fluoro beta-glucosyl fluoride, with kinetic parameters of k(i) = 4.5 min(-1), K(I) = 35.4 mM, through the trapping of a covalent glycosyl enzyme intermediate. The catalytic competence of this intermediate was demonstrated by the fact that incubation with linamarin resulted in reactivation, presumably via a transglycosylation mechanism. Peptic digestion of the 2-deoxy-2-fluoroglucosyl enzyme and subsequent analysis of high pressure liquid chromatography eluates by electrospray ionization triple quadrupole mass spectrometry in the neutral loss mode allowed the localization of a 2-deoxy-2-fluoroglucosyl-peptide. Sequence determination of this labeled peptide by tandem mass spectrometry in the daughter ion scan mode permitted the identification of Asp-261 as the catalytic nucleophile within the sequence VMSDW. Asp-261 is fully conserved within this family, consistent with its key role, and aligns with the aspartic acid residue previously identified in the Aspergillus wentii enzyme by labeling with conduritol B epoxide (Bause, E., and Legler, G. (1974) Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 355, 438-442).
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».