Coincidence Measurements in Dual-Color Confocal Microscopy: A Combined Single-Particle and Fluorescence Correlation Approach
Notice bibliographique
Résumé
In this paper we discuss how the coincident detection of mobile particles in dual-color confocal images can be improved. Optimal coincidence detection requires a careful choice of experimental conditions and image acquisition parameters in order to maximize the overlap between the two detection volumes. By measuring this overlap with fluorescence cross-correlation spectroscopy, we show in particular that a small confocal field of view is necessary in order to maintain good coincidence. Most importantly, coincidence detection also requires a dedicated image analysis strategy. Traditionally, two approaches have been adopted to assess coincidence of mobile particles: fluorescence fluctuation measurements, notably cross-correlation spectroscopy, and single particle detection. Here we propose to combine these two approaches by calculating a cross-correlation coefficient for each of the detected single particles. We show that this allows to remove accidental coincidence events from a data set, and thus to unambiguously identify particles that instead carry two different fluorophores. This strategy can help increase the available concentration range for confocal coincidence measurements and detect rare binding events. [Formula: see text]Special Issue Comments: This article about coincident detection of mobile particle in two-color confocal images is thematically related to several articles in this Special Issue, namely the review of FRET-based single-molecule fluorescence techniques by Ruedas-Rama et al.,1 the single particle detection work presented by de Keersmaecker et al.2 and the general considerations on the mathematical treatment of single molecule trajectories presented by Flomenbom3. Our study of single liposomes is also relevant to experiments involving proteins and liposomes, such as the enzyme experiments described in the review by Jørgensen and Hatzakis.4
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,002 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,002 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,003 | 0,003 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».