Flow cytometric measurement of calpain activity in living cells
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Calpains are intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases that play crucial roles in many physiological and pathological processes. Calpain regulation is complex and activity is poorly correlated with calpain protein levels. Therefore a full understanding of calpain function requires robust methods for measuring activity. METHODS: We describe and characterize a flow cytometric method for measuring calpain activity in live cells. This method uses the BOC-LM-CMAC reagent that readily diffuses into cells where it reacts with free thiols to enhance retention. RESULTS: We show that the reagent is cleaved specifically by calpains and follows saturation kinetics. We use the assay to measure calpain activation following PDGF stimulation of rat fibroblasts. We also show that the calpain inhibitor PD150606 inhibits calpain with a K(i) of 12.5 muM and show that Mek inhibitors PD89059 and U0126 also suppress calpain activity. We also show that the assay can measure calpain activity in subpopulations of cells present in unfractionated cord blood or in HL60 human myelomonocytic leukemia cells. CONCLUSION: Taken together, these experiments demonstrate that this assay is a reliable and useful method for measuring calpain activity in multiple cell types.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,006 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».