Affinity Analysis of a Protein−Aptamer Complex Using Nonequilibrium Capillary Electrophoresis of Equilibrium Mixtures
Notice bibliographique
Résumé
We propose a new method that allows the use of low-affinity aptamers as affinity probes in quantitative analyses of proteins. The method is based on nonequilibrium capillary electrophoresis of the equilibrium mixture (NECEEM) of a protein with its fluorescently labeled aptamer. In general, NECEEM of a protein with a fluorescently labeled aptamer generates an electropherogram with three characteristic features: two peaks and an exponential curve. Two peaks correspond to (i) the equilibrium amount of free aptamer in the equilibrium mixture and (ii) the amount of the protein-aptamer complex that remains intact at the time of detection. The exponential part is ascribed to the complex decaying during separation under nonequilibrium conditions. Simple analysis of the three features in experiments with known concentrations of the protein can be used for the determination of the equilibrium dissociation constant, Kd, of the aptamer-protein complex. Similar analysis of the three features in the experiment with unknown concentration of the protein and known Kd value allows the determination of the protein concentration. In this proof-of-principle work, the NECEEM method was applied to the analysis of thrombin using a fluorescein-labeled aptamer under the conditions at which the protein-aptamer complex completely decayed during the separation. We demonstrated that, despite the decay, as few as 4 x 10(6) molecules of the protein could be detected with NECEEM without sacrificing the accuracy. This sensitivity is comparable with that reported by others for the aptamer-based equilibrium method. Thus, the proposed NECEEM-based method allows the use of aptamers for highly sensitive affinity analysis of proteins even when protein-aptamer complexes are unstable.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».