Sequencing and validation of housekeeping genes for quantitative real-time PCR during the gonadotrophic cycle of Diploptera punctata
Notice bibliographique
Résumé
BACKGROUND: Quantitative RT-PCR (q-RT-PCR) is a powerful tool that allows for the large scale analysis of small changes in gene expression. Accurate and reliable results depend on the use of stable reference genes for normalization. However, the expression of some widely used housekeeping genes can vary under different experimental setups. To our knowledge, no validation studies have been reported for reference genes in cockroaches. The aim of the current study is the identification and validation of a set of eight housekeeping genes during the first gonadotrophic cycle of the cockroach, Diploptera punctata. This study made use of two different algorithms (geNorm and Normfinder) to evaluate the stability of gene expression. RESULTS: Candidate housekeeping genes were sequenced: β-actin (Actin), elongation factor 1 alpha (EF1a), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), armadillo (Arm), ribosomal protein L32 (RpL32), succinate dehydrogenase (SDHa), annexin IX (AnnIX) and α-tubulin (Tub). The expression of these eight genes was analyzed in corpora allata (CA) and ovaries of adult female D. punctata. Both geNorm, as well as Normfinder characterized SDHa, EF1a and Arm as being the most stably expressed in the corpora allata. In the ovary, the geNorm calculation showed Tub, EF1a and RpL32 to be most stable, whereas Normfinder identified Tub, EF1a and Arm as the best. In ovary, the least stable gene was Actin, challenging its usefulness in normalization. As a proof of principle, the expression of follicle cell protein 3c and CYP15A1 was monitored during the first gonadotrophic cycle. CONCLUSION: Arm and EF1a form the most stably expressed combination of two reference genes out of the eight candidates that were tested in the corpora allata. Our results show that the combined use of Tub, EF1a and RpL32 ensures an accurate normalization of gene expression levels in ovary of D. punctata. Our study has indicated that neither Actin nor AnnIX should be used for normalization of transcript levels when studying the first gonadotrophic cycle in CA or ovary of D. punctata. The results stress the necessity for validation of reference genes in q-RT-PCR studies in cockroaches.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,003 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».