Reengineering natural design by rational design and in vivo library selection: the HLH subdomain in bHLHZ proteins is a unique requirement for DNA-binding function
Notice bibliographique
Résumé
To explore the role of the HLH subdomain in bHLHZ proteins, we designed sets of minimalist proteins based on bHLHZ protein Max, bHLH/PAS protein Arnt and bZIP protein C/EBP. In the first, the Max bHLH and C/EBP leucine zipper were fused such that the leucine heptad repeats were not in register; therefore, the protein dimerization interface was disrupted. Max1bHLH-C/EBP showed little ability to activate transcription from the E-box (5'-CACGTG) in the yeast one-hybrid assay, and no E-box binding by quantitative fluorescence anisotropy. Max1bHLH-C/EBP's activity was significantly improved after library selection (three amino acids randomized between HLH and leucine zipper), despite the Max bHLH and C/EBP zipper still being out of register: a representative mutant gave a high nanomolar K(d) value for E-box binding. Thus, selection proved to be a powerful tool for salvaging the flawed Max1bHLH-C/EBP, although the out-of-register mutants still did not achieve the strong DNA-binding affinities displayed by their in-register counterparts. ArntbHLH-C/EBP hybrids further demonstrated the importance of maintaining register, as out-of-register mutants showed no E-box-responsive activity, whereas the in-register hybrid showed moderate activity. In another design, we eliminated the HLH altogether and fused the Max basic region to the C/EBP zipper to generate bZIP-like hybrids. Despite numerous designs and selections, these hybrids possessed no E-box-responsive activity. Finally, we tested the importance of the loop sequence in MaxbHLHZ by fluorescence and circular dichroism. In one mutant, the loop was shortened by two residues; in the other, the Lys57:DNA-backbone interaction was abolished by mutation to Gly57. Both showed markedly decreased E-box-binding relative to MaxbHLHZ. Our results suggest that, in contrast to the more rigid bZIP, the HLH is capable of significant conformational adaptation to enable gene-regulatory function and is required for protein dimerization and positioning the basic region for DNA recognition.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».