Progesterone inhibits protein kinase A (PKA) in<i>Xenopus</i>oocytes: demonstration of endogenous PKA activities using an expressed substrate
Notice bibliographique
Résumé
3'-5' cyclic adenosine monophosphate (cAMP)-dependent protein kinase, PKA, is thought to be a key enzyme that controls prophase arrest in vertebrate oocytes. It has long been established that overexpression of the catalytic subunit of PKA inhibits hormone-induced frog oocyte maturation whereas overexpression of the regulatory subunits induces hormone-independent oocyte maturation. However, the activities of endogenous oocyte PKA, or its regulation by the maturation-inducing hormone progesterone, have never been directly demonstrated in frog oocytes. We have developed a novel expressed substrate for PKA in live oocytes by constructing a fusion protein containing an N-terminal myristylation sequence (derived from the Src tyrosine kinase) followed by an antigenic epitope tag and a substrate motif (the C-terminal cytoplasmic domain of beta2 adrenergic receptor). Following mRNA injection, the phosphorylation status of the substrate was determined by two-dimensional electrophoresis followed by epitope immunoblotting, or alternatively by SDS-PAGE followed by immunoblotting using antibodies specifically recognizing the PKA-phosphorylated form of the substrate. In prophase oocytes, the expressed protein, myr-HA-beta2AR-C, was fully phosphorylated on a single PKA site (Ser346 of human beta2 adrenergic receptor). Within one hour of the addition of progesterone, the PKA site became mostly dephosphorylated. No re-phosphorylation of the PKA site, and therefore no reactivation of PKA, was observed throughout the entire maturation process. To demonstrate the generality of this PKA substrate, we analyzed its phosphorylation status in COS-7 cells following transfection. We show that dibutyryl cAMP rapidly stimulates phosphorylation of the PKA site. These results represent the first biochemical demonstration of regulation of endogenous Xenopus oocyte PKA by progesterone. Furthermore, myr-HA-beta2AR-C should be widely adaptable as an in vivo PKA activity indicator.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».