Engineering a rare-cutting restriction enzyme: genetic screening and selection of NotI variants
Notice bibliographique
Résumé
Restriction endonucleases (REases) with 8-base specificity are rare specimens in nature. NotI from Nocardia otitidis-caviarum (recognition sequence 5'-GCGGCCGC-3') has been cloned, thus allowing for mutagenesis and screening for enzymes with altered 8-base recognition and cleavage activity. Variants possessing altered specificity have been isolated by the application of two genetic methods. In step 1, variant E156K was isolated by its ability to induce DNA-damage in an indicator strain expressing M.EagI (to protect 5'-NCGGCCGN-3' sites). In step 2, the E156K allele was mutagenized with the objective of increasing enzyme activity towards the alternative substrate site: 5'-GCTGCCGC-3'. In this procedure, clones of interest were selected by their ability to eliminate a conditionally toxic substrate vector and induce the SOS response. Thus, specific DNA cleavage was linked to cell survival. The secondary substitutions M91V, F157C and V348M were each found to have a positive effect on specific activity when paired with E156K. For example, variant M91V/E156K cleaves 5'-GCTGCCGC-3' with a specific activity of 8.2 x 10(4) U/mg, a 32-fold increase over variant E156K. A comprehensive analysis indicates that the cleavage specificity of M91V/E156K is relaxed to a small set of 8 bp substrates while retaining activity towards the NotI sequence.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».