Fluorescence polarization immunoassays for monitoring nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) activity
Notice bibliographique
Résumé
The following members of the ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase family, NTPDase1 (CD39), NTPDase-2, -3, and -8, play an important role in purinergic signal transduction by regulating extracellular nucleotide levels. Potent and selective NTPDase inhibitors are required as pharmacological tools and have potential as novel drugs, e.g. for anti-cancer and anti-bacterial therapy. We have developed fast and sensitive NTPDase fluorescence polarization (FP) immunoassays using the natural substrates (ATP or ADP). During the NTPDase1-catalyzed reaction, the substrate is dephosphorylated to ADP which is further dephosphorylated yielding AMP as the final product (by NTPDase1). NTPDase3 and -8 yield AMP and ADP, while NTPDase2 results mainly in the formation of ADP. Direct quantification of the respective product, AMP or ADP, is achieved by displacement of an appropriate fluorescent tracer nucleotide from a specific antibody leading to a change in fluorescence polarization. The assays are highly sensitive and can be performed with low substrate concentrations (20 μM ATP or 10 μM ADP) below the KM values of NTPDases, which simplifies the identification of novel competitive inhibitors. Optimized antibody and enzyme concentrations allow the reproducible detection of 2 μM ADP and 1 μM AMP (at 10% substrate conversion). Validation of the assays yielded excellent Z'-factors greater than 0.70 for all investigated NTPDase subtypes indicating high robustness of the analytical method. Furthermore, we tested a standard inhibitor and performed a first exemplary screening campaign with a library consisting of >400 compounds (Z'-factor: 0.87, hit rate 0.5%). Thereby we demonstrated the suitability of the FP assay for IC50 value determination and high-throughput screening in a 384-well format. The new FP assays were shown to be superior to current standard assays.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».