Validation of the comparative quantification method of real-time PCR analysis and a cautionary tale of housekeeping gene selection
Notice bibliographique
Résumé
Real-time reverse transcription PCR (RT-PCR) is now widely used for quantifying levels of expressed gene transcripts. The present study validates the use of a new RT-PCR analysis method, Comparative Quantification, by comparing it against the 'gold standard' Comparative Threshold Cycle method. The former method calculates individual PCR reaction efficiencies, obviating the need for multiple PCRs to generate standard curves from serial dilutions of sample. Real-time reverse transcription PCR was used to verify expression of 18 genes suggested by microarray analysis of schizophrenia versus control fibroblasts. A high correlation (R=0.853) was observed between the two methods, validating Comparative Quantification as a method of RT-PCR data analysis, with the advantage that it is also a quicker and cheaper method. Also, RT-PCR compares the relative expression of target genes to the expression of a reference or "housekeeping" gene in the sample, which is assumed to have stable expression across all samples. Variable expression of the reference gene would reveal itself as a false change in expression in the target gene. The present study investigates the expression of "housekeeping" genes in fibroblast cultures from patients with schizophrenia and matched healthy controls. The results reveal consistent patient versus control differences in expression of commonly used "housekeeping" genes, including GAPDH. We propose that researchers derive housekeeping genes from stable expression data in the system studied and disregard previously published housekeeping genes when designing their real-time PCR experiments.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,099 | 0,081 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,003 | 0,002 |
| Bibliométrie | 0,003 | 0,003 |
| Études des sciences et des technologies | 0,002 | 0,008 |
| Communication savante | 0,004 | 0,003 |
| Science ouverte | 0,005 | 0,003 |
| Intégrité de la recherche | 0,004 | 0,008 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».