A highly sensitive method for quantification of myosin light chain phosphorylation by capillary isoelectric focusing with laser‐induced fluorescence detection
Notice bibliographique
Résumé
Activation of myosin II by phosphorylation of the 20 kDa regulatory light chains (LC20) has been implicated in numerous contractile and motile events, e.g., smooth muscle contraction, cytokinesis, and cell migration. The ability to analyze LC20 phosphorylation in minute samples is critical to determine the importance of LC20 phosphorylation in diverse physiological processes. We have developed a method for the separation and quantification of unphosphorylated, monophosphorylated, and diphosphorylated LC20 with a detection limit of 1 pg (50 amol). LC20 is initially isolated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and transblotted to a polyvinlyidene difluoride (PVDF) membrane. The region of the membrane containing the LC20 band (identified by electrophoresis of purified LC20 in a neighboring lane) is cut out and fluorescently labeled with Alexa Fluor 488 C5 maleimide. The labeled LC20 is eluted from the membrane with detergent and subjected to capillary isoelectric focusing (CIEF) to separate unphosphorylated, mono-, and diphosphorylated LC20, which are detected and quantified by laser-induced fluorescence (LIF). A linear relationship between log(peak area) and log(LC20 amount) is observed over the range of 50 amol-150 fmol. Quantification of LC20 phosphorylation by CIEF with LIF detection was compared with three commonly used methods with much lower levels of sensitivity: urea/glycerol-PAGE with Western blotting, phosphorylation by [gamma-32P]ATP with Cerenkov counting, and phosphorylation by [gamma-32P]ATP followed by SDS-PAGE, autoradiography, and scanning densitometry. All four methods gave very similar quantitative results, the major difference being that the new method exhibits 3000-fold enhanced sensitivity. This method is therefore applicable to quantitative analysis of phosphorylation of minute quantities of LC20.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,002 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,003 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,002 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,005 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,002 | 0,004 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,003 | 0,004 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».