An alternative kinase activity assay for primary cultures derived from clinical isolates
Notice bibliographique
Résumé
PURPOSE: The measurement of protein kinase activity is central to understanding the signaling pathways that regulate cellular proliferation and apoptosis in virtually all disease processes. These measurements typically involve either indirect, time consuming assessment methods that require large amounts of sample, such as western immunoblotting, or the use of high maintenance, specialized equipment not typically available to a small clinical research facility. The purpose of this project was to determine if a benchtop Surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS) unit could be used to detect and directly assess kinase activity of the serine/threonine kinase Akt. METHOD: Biotinylated substrate peptides, predicted to be recognized and phosphorylated by Akt to varying extents, were incubated in crude lysates of primary cells derived directly from clinical isolates. Streptavidin-coated chips were then used to isolate the substrate peptides from the lysates after incubation. Finally SELDI-TOF-MS was used to detect the peptide substrates and identify any changes in mass resulting from phosphorylation. RESULTS: The biotinylated peptide substrates were readily detected and a simple, rapid procedure that allows direct measurement of Akt activity in less than 1 microg of cell lysate in a 2microL volume was developed. Further, a linear correlation between native to phospho-peptide ratios and SELDI-TOF-MS output demonstrated that this approach is semi-quantitative. CONCLUSION: This assay avoids many of the pitfalls associated with the currently available kinase protocols as well as labour-intensive mass-spectrometry analysis by specialist laboratories. We propose that this approach may be a viable alternative for clinical research laboratories aiming to measure the activity of kinases in clinical isolates.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,003 | 0,004 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».