Small-scale Subcellular Fractionation with Sucrose Step Gradient
Notice bibliographique
Résumé
Here, we introduce the protocol for small-scale and simple subcellular fractionation used in our recent publication (Taguchi et al., 2013), which uses homogenization by passing through needles and sucrose step-gradient. Subcellular fractionation is a very useful technique but usually a large number of cells are required. Because we needed subcellular fractionation of transiently-transfected cells, we developed a protocol for smaller numbers of cells. Our protocol for the subcellular fractionation is based on the protocol published by de Araújo and Huber (de Araujo et al., 2007), although substantial modifications have been made according to our experiences and information from personal communications. As optimal conditions seem to vary between cell lines, we advise to further modify the protocol to optimize for individual experiments. Our method is simple but sufficient for analysis of integral membrane proteins or proteins anchored to organelles by glycosylphosphatidylinositol or other lipid anchors, e.g. prion protein. However, proteins non-covalently attached to membranes or membrane proteins of organelles seem to be more prone to dissociation from the organelles during preparation and, if these proteins are the object of study, further modifications might be necessary. Unlike in a continuous gradient, where a protein of interest is scattered over a wide range, step-gradient fractionation is advantageous in detection of relatively small amounts of proteins from small-scale experiments, because it concentrates the protein of interest in one fraction, if an appropriate combination of sucrose concentrations is used., 在这里，我们介绍了在我们最近的出版物（Taguchi等人，2013）中使用的用于小规模和简单的亚细胞分离的方案，其通过穿过针和蔗糖梯度梯度使用匀浆。 亚细胞分离是一种非常有用的技术，但通常需要大量的细胞。因为我们需要瞬时转染细胞的亚细胞分离，我们开发了用于较小数量细胞的方案。我们的用于亚细胞分级的方案基于deAraújo和Huber（de Araujo等人，2007）公布的方案，尽管根据我们的经验和来自个人通信的信息进行了实质性的修改。由于最佳条件似乎在细胞系之间不同，我们建议进一步修改方案以优化个别实验。我们的方法很简单，但足以分析通过糖基磷脂酰肌醇或其他脂质锚例如朊病毒蛋白锚定到细胞器的内在膜蛋白或蛋白质。然而，非共价连接到膜或细胞器的膜蛋白的蛋白质似乎更容易在制备过程中从细胞器中解离，并且如果这些蛋白质是研究的目的，则可能需要进一步的修饰。 不同于连续梯度，其中感兴趣的蛋白质分散在宽范围内，步梯度分级分离在小规模实验中检测相对少量的蛋白质是有利的，因为它将感兴趣的蛋白质浓缩如果使用蔗糖浓度的适当组合。
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».