Optimisation de la production de protéines recombinantes avec des cellules de tabac en suspension

J'aimerais remercier mes directeurs de recherche, les Pr.Mario Jolicoeur, Grégory De Crescenzo et Daniel P. Matton pour m'avoir accueilli dans leurs laboratoires, pour leur encadrement, leurs judicieux conseils et leurs encouragements.Je tiens également à les remercier pour m'avoir apporté une nouvelle vision de la recherche, plus appliquée que celle que mes études antérieures m'ont donnée.Je souhaite également remercier tous mes collègues de travail pour leur aide, leurs conseils et pour la bonne ambiance qu'ils ont fait régner au laboratoire.J'aimerais particulièrement remercier Steve pour m'avoir transmis tout son savoir en ce qui concerne la culture de cellules de plantes, Mathieu pour les cultures en bioréacteur et le Virgo, Zeina pour les analyses de Differential display, et Martin, Hugo et Éric C. pour leur conseils concernant plusieurs méthodes de biologie moléculaire.J'aimerais également souligner le précieux travail des techniciens, Martine, Gino, Lionel, Michelle, Carol, Jean, Robert qui m'ont aidé lors de la réalisation de ce projet.De même, j'aimerais remercier le personnel du secrétariat du département de génie chimique, en particulier Louise, Lyne, Chantal F., Chantal B et Brigitte pour leur aide avec les problèmes administratifs et les commandes.Enfin, un gros merci à mes amis et collègues, en particulier Virginie, Marisha, Jingkui, Cyril, Aline, Antoine, Anne et Ines pour leurs oreilles attentives et leurs encouragements.Un gros merci également à Guillaume, pour le réconfort qu'il m'a apporté, la tranquillité de son condo et sa machine à café.v RÉSUMÉ La demande croissante pour des protéines recombinantes à faible coût stimule l'industrie à développer de nouvelles plateformes de production.Parmi celles-ci, la plateforme végétale in vitro gagne en intérêt.Permettant l'utilisation d'un milieu de culture entièrement synthétique, exempt de protéines et qui ne favorise pas le développement de pathogènes humains, les cellules de plantes peuvent effectuer des modifications post-traductionnelles et mener à des molécules bioactives.Plusieurs protéines produites en plantes sont d'ailleurs en phase d'essais cliniques.Toutefois, les faibles rendements en protéines recombinantes obtenus avec les cellules de plantes limitent la compétitivité de cette plateforme novatrice.Les travaux de recherche regroupés dans cette thèse visent l'amélioration des rendements en protéines recombinantes produites par des cellules de tabac en suspension.L'objectif principal a consisté en l'optimisation de la production de protéines recombinantes en cellules de tabac, dans le contexte d'un bioprocédé en bioréacteur.En objectifs spécifiques, la co-culture de cellules de plantes avec Agrobacterium permettant d'exprimer de façon transitoire un gène d'intérêt et un suppresseur viral, ainsi que l'identification et l'isolation de promoteurs forts inductibles au froid ont été étudiées.De manière à présenter une vue globale de la situation actuelle du marché et de l'industrie, une revue détaillée a été réalisée et soumise au journal Plant Biotechnology Journal (février 2010).Dans la première partie de cet article, l'ensemble des plateformes de production de protéines recombinantes établies de même que celles en émergence sont décrites en détail et leurs niches spécifiques sont présentées.Par la suite, les innovations récentes rapportées dans la littérature pour la plateforme végétale in vitro, telles que l'optimisation des cassettes d'expression vi et des paramètres de bioprocédés et l'utilisation de suppresseurs viraux de répression génique sont présentées et discutées.Dans un deuxième temps, un chapitre présente une étude démontrant la faisabilité de produire des protéines recombinantes de façon transitoire, dans des cellules de plantes en suspension, en les cocultivant avec des populations d'Agrobacterium compétentes à transférer des plasmides contenant divers gènes d'intérêt.Il a ainsi été démontré que l'expression transitoire d'un suppresseur viral de répression génique tel que p19, simultanément à l'expression également transitoire d'un gène d'intérêt, augmente de manière significative le rendement en protéines recombinantes.Ces travaux ont été consignés dans un second article soumis au journal Biotechnology Progress (février 2010).Plus précisément, des cellules de Nicotiana benthamiana ont été cocultivées avec deux souches d'Agrobacterium différentes, l'une ayant une construction pour l'expression d'un gène d'intérêt, un anticorps IgG1 de souris, l'autre codant pour le suppresseur viral p19.Ces travaux de coculture transitoire ont permis de démontrer, pour la première fois, que la co-transformation de cellules de plante en suspension avec deux vecteurs de transformation est possible, et que l'utilisation d'un suppresseur viral augmente significativement la production de protéines recombinantes, de manière similaire à ce qui est observé pour des feuilles de la même plante agroinfiltrées.Il a également été déterminé que l'utilisation d'une approche transitoire pour l'expression du suppresseur viral pourrait être préférable à l'établissement d'une lignée exprimant constitutivement le suppresseur.Selon les résultats présentés dans cette thèse, la suppression du mécanisme de répression génique causée par p19 et qui est reliée à son niveau d'expression, pourrait être plus élevée dans le cas transitoire à cause d'un phénomène de surexpression des transgènes (dont p19) en situation transitoire.Dans un troisième temps, l'identification et l'isolation de promoteurs forts inductibles au froid dans N. tabacum ont été initiées.Tel qu'expliqué dans la revue de la littérature, des vii systèmes de production inductibles au froid sont présentement en développement dans des cellules microbiennes et de mammifères; le froid étant identifié comme un paramètre pouvant permettre d'augmenter les rendements en protéines actives et correctement repliées, tout en diminuant les actions néfastes des protéases.À notre connaissance, il n'existe pas de système similaire en plante avec une perspective de production de protéines recombinantes.Les cellules de plantes sont normalement cultivées entre 23 et 27°C, et les effets d'un stress à 12°C ou 18°C pendant 6, 12, 24 et 48 heures sur la biomasse et la concentration en protéines ainsi que le pH extracellulaire ont été caractérisés.En utilisant une méthode d'expression différentielle (Differential Display), des fragments de la région 3'-non-traduite (UTR) de quelques gènes potentiellement induits au froid ont été isolés.La validation de ces candidats a été initiée en utilisant des analyses Northern et Northern inversé, mais n'a pas résulté, à ce jour, à l'identification claire de promoteurs candidats.Les bases de données existantes ont été criblées en utilisant une stratégie de BLAST; ce qui a permis de réduire le nombre de nos candidats potentiels.Une méthode d'amplification rapide du bout 5' de l'ADN complémentaire (5'-RACE) a été réalisée sur les candidats ciblés afin d'augmenter la longueur de la séquence connue des gènes.Toutefois, aucun des fragments isolés avec cette méthode n'étaient reliés aux candidats retenus.Les travaux effectués sont donc présentés afin de guider d'éventuels travaux sur ce sujet.Dans cette thèse, la faisabilité d'un système d'expression transitoire, combinant des cellules de plantes avec plusieurs lignées d'Agrobacterium a été démontrée de même que l'importance d'exprimer de manière transitoire un suppresseur viral pour augmenter les rendements en protéines recombinantes.Toutefois, beaucoup de travail demeure à faire en ce qui concerne l'identification et l'isolation de promoteurs inductibles au froid.

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