Assembly of Hemoglobin from Denatured Monomeric Subunits: Heme Ligation Effects and Off-Pathway Intermediates Studied by Electrospray Mass Spectrometry
Notice bibliographique
Résumé
The oxygen binding properties of vertebrate hemoglobins (Hb) have been explored in great detail. In contrast, folding and assembly of these heterotetrameric protein complexes remain poorly understood. Similar to investigations of other multisubunit systems, in vitro Hb refolding experiments are often plagued by aggregation. Here we monitor the refolding of bovine Hb by electrospray mass spectrometry (ESI-MS). This technique allows the observation of coexisting subunit combinations, heme binding states, and protein conformers. Exposure to 40% acetonitrile at pH 10 causes Hb disassembly and extensive subunit unfolding. Hb reassembly is triggered by solvent exchange. Experiments conducted at room temperature provide a low metHb refolding yield. A significantly improved yield is achieved by lowering the temperature to 4 °C and by supplementing the protein solution with KCN prior to denaturation. Comparative studies under "low-yield" and "high-yield" conditions report on the interplay between folding and misfolding. The tendency of β-globin to undergo aggregation is found to be the key impediment to the formation of native Hb. The α/β imbalance generated in this way favors the formation of non-native α-globin assemblies. Our data imply that hemin dicyanide formed in the presence of KCN remains weakly bound to denatured β-globin, thereby counteracting aggregation, such that the refolding yield is enhanced. In the absence of aggregation-related interference, Hb assembly follows a symmetric pathway. Monomeric α- and β-globin adopt a compact conformation upon heme binding. Heme-bound monomers then form heterodimers, and ultimately heterodimer association results in native Hb. This work highlights the utility of time-resolved ESI-MS investigations for interrogating the kinetic competition between on-pathway events and aberrant side reactions during the self-assembly of biomolecular complexes.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».