Abstract 64: Development of homogeneous non-radioactive assays for studying histone 3 methyltransferases and demethylases
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Post-translational modifications of histones are among the epigenetic mechanisms that can affect chromatin structure and function. Disruption of epigenetic processes can lead to altered gene expression and malignant cellular transformation. Epigenetic changes including histone acetylation, histone methylation and DNA methylation are now considered to play important roles in the initiation and progression of cancer. Histone methylation and demethylation are enzymatically dynamic processes controlled respectively by histone methyltransferases (HMTs) and histone demethylases (HDMs). Several assay methods have been developed for quantifying the activity of HMTs and HDMs. These include radioactive assays, enzyme-linked immunoassays (ELISA), mass spectrometry, and enzyme-coupled detection of reaction co-products (e.g. S-adenosylhomocysteine, formaldehyde, hydrogen peroxide). These assays suffer from various drawbacks such as low throughput, lack of sensitivity, generation of hazardous waste, requirement for expensive equipment, or artifacts associated with the use of enzyme-coupled assays (generation of false positives/negatives). In this study, we describe homogeneous (mix-and-read) assays for measuring the catalytic activity of both HMTs and HDMs acting on histone H3 using two different non-radioactive technologies: amplified luminescent proximity homogeneous assay (AlphaLISA) and time-resolved fluorescence energy transfer (LANCE). The EZH2 complex (which methylates histone H3 on lysine 27) and LSD1 and JMJD2A (which demethylate di-methyl lysine 4 and tri-methyl lysine 36, respectively, on histone H3) were selected as model enzymes due to their association with various human diseases. Assays were developed in 384-well format and used as substrates two synthetic biotinylated peptides derived from the N-terminus of histone H3 (amino acids 1 to 21 for LSD1 and 21 to 44 for EZH2 and JMJD2A). All assays were designed as signal-increase homogeneous assays, where direct detection of product formation was conducted using methyl-state selective antibodies conjugated to either AlphaLISA acceptor beads or LANCE europium chelate. Results demonstrated that all assays were sensitive and robust. Furthermore, profiling of known inhibitors for each epigenetic enzyme showed the expected potency with either technology. These assays will therefore be ideal for the identification of selective small molecule inhibitors.Although these studies focused on EZH2, JMJD2A and LSD1 enzymes, the approach described here is broadly suitable for measuring the catalytic activity of other HMTs and HDMTs by combining the appropriate biotinylated histone-derived peptides and methyl-state selective antibodies. Citation Format: {Authors}. {Abstract title} [abstract]. In: Proceedings of the 102nd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research; 2011 Apr 2-6; Orlando, FL. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2011;71(8 Suppl):Abstract nr 64. doi:10.1158/1538-7445.AM2011-64
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,002 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».