Cell-Based Identification of Natural Substrates and Cleavage Sites for Extracellular Proteases by SILAC Proteomics
Notice bibliographique
Résumé
Proteolysis is one of the most important post-translational modifications of the proteome with every protein undergoing proteolysis during its synthesis and maturation and then upon inactivation and degradation. Extracellular proteolysis can either activate or inactivate bioactive molecules regulating physiological and pathological processes. Therefore, it is important to develop non-biased high-content screens capable of identifying the substrates for a specific protease. This characterization can also be useful for identifying the nodes of intersection between a protease and cellular pathways and so aid in the detection of drug targets. Classically, biochemical methods for protease substrate screening only discover what can be cleaved but this is often not what is actually cleaved in vivo. We suggest that biologically relevant protease substrates can be best found by analysis of proteolysis in a living cellular context, starting with a proteome that has never been exposed to the activity of the examined protease. Therefore, protease knockout cells form a convenient and powerful system for these screens. We describe a method for identification and quantification of shed and secreted cleaved substrates in cell cultures utilizing the cell metabolism as a labelling system. SILAC (stable isotope labelling by amino acids) utilises metabolic incorporation of stable isotope-labelled amino acids into living cells. As a model system to develop this approach, we chose the well-characterised matrix metalloproteinase, MMP-2, because of its importance in tumour metastasis and a large database of MMP substrates with which to benchmark this new approach. However, the concepts can be applied to any extracellular or cell membrane protease. Generating differential metabolically labelled proteomes is one key to the approach; the other is the use of a negative peptide selection procedure to select for cleaved N-termini in the N-terminome. Using proteomes exposed or not to a particular protease enables biologically relevant substrates and their cleavage sites to be identified and quantified by tandem mass spectrometry proteomics and database searching.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».