Functional Analysis of Human D1 and D5 Dopaminergic G Protein-Coupled Receptors: Lessons from Mutagenesis of a Conserved Serine Residue in the Cytosolic End of Transmembrane Region 6
Notice bibliographique
Résumé
In mammals, dopamine G protein-coupled receptors (GPCR) are segregated into two categories: D1-like (D1R and D5R) and D2-like (D2R(short), D2R(long), D3R, and D4R) subtypes. D1R and D5R are primarily coupled to stimulatory heterotrimeric GTP-binding proteins (Gs/olf) leading to activation of adenylyl cyclase and production of intracellular cAMP. D1R and D5R share high level of amino acid identity in transmembrane (TM) regions. Yet these two GPCR subtypes display distinct ligand binding and G protein coupling properties. In fact, our studies suggest that functional properties reported for constitutively active mutants of GPCRs (e.g., increased basal activity, higher agonist affinity and intrinsic activity) are also observed in cells expressing wild type D5R when compared with wild type D1R. Herein, we describe an experimental method based on mutagenesis and transfection of human embryonic kidney 293 (HEK293) cells to explore the molecular mechanisms regulating ligand affinity, agonist-independent and dependent activity of D1R and D5R. We will demonstrate how to mutate one conserved residue in the cytosolic end of TM6 of D1R (Ser263) and D5R (Ser287) by modifying two or three nucleotides in the cDNA of human D1-like receptors. Genetically modified D1R and D5R cDNAs are prepared using a polymerase chain reaction method, propagated in E. coli, purified and mutations confirmed by DNA sequencing. Receptor expression constructs are transfected into HEK293 cells cultured in vitro at 37°C in 5% CO(2) environment and used in radioligand binding and whole cAMP assays. In this study, we will test the effect of S263A/G/D and S287A/G/D mutations on ligand binding and DA-dependent activation of D1R and D5R.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».