A Search for Genes Specifying HSCs through the Development of a New Retroviral-Based System That Creates Nested Deletions in ES cells.
Notice bibliographique
Résumé
Abstract With the intention of identifying novel DNA segments essential for hematopoietic stem cell (HSC) specification, we have taken advantage of retroviral-based delivery of loxP sequences to ES cells in order to create large genomic deletions. Cre-induced recombination between the integrated loxP-containing proviruses is selected based on the reconstitution of a functional neomycin resistance cassette. A unique set of complementary retroviruses (virus A and D) was finally identified after the generation and testing of more than 10 different cassettes. The nature of the rearrangements produced (deletions, inversions, etc.) was determined according to the sensitivity to selection marker genes incorporated inside the viruses and confirmed by Southern blot analysis of genomic DNA extracted from selected clones. The new technology was first tested on 11 different clones infected at a low MOI of virus D (to obtain one integrant per cell). This virus, selected under puromycin, contains also a neomycin resistance gene (neor), devoid of an initiation codon (ATG) and of a functional promoter. The proviral integration sites are now easily determined by inverse PCR using primers anchored at the neor gene. The second retrovirus (virus A), selected with hygromycin, integrates randomly another loxP site and a pgk promoter which precedes the ATG-loxP cassette. For the 11 primary clones tested to date, the number of secondary clones derived ranged between 7000 and 37 000. Recombination between the loxP sites, upon Cre addition, is selected by the functional reconstitution of the neomycin gene (i.e. pgk-ATG-loxP-neor). Out of 107cells electroporated with the cre plasmid, neomycin resistant clones were obtained for each population (ranging between 7 and 188). Rearranged tertiary clones (i.e., virus D+A+Cre) derived from a selected primary clone (no.9) have been studied extensively by Southern Blot analysis. Chromosomal rearrangements correlated with bands of expected sizes (3.0 kb compare to 3.4 kb for the unrearranged primary and secondary clones, using KpnI digests and a neomycin probe). Clonal analysis for integration of the second retrovirus (virus A) revealed at least 13 different deletions out of 34 tested. In one experiment, very preliminary results suggest that 3 out of these 13 clones bearing independent deletions failed to differentiate upon LIF removal. Among the other 10 primary clones saturated to date, 9 gave tertiary clones sensitive to puromycin (undergoing selection). Overall, these results document that our novel retroviral-based strategy is amenable to functional screening of genes that specify HSC in differentiating ES cells. Moreover, this technology is efficient (11 out of 11 clones tested), rapid and applicable to any cellular system.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».