A novel method to stabilize weak protein complexes for crystallographic studies
Notice bibliographique
Résumé
Most protein interactions mediating critical steps in cellular pathways are transient and, hence, are difficult to capture using structural approaches. An example from Saccharomyces cerevisiae is the interaction between checkpoint effector Rad53 kinase and replication initiation Dbf4-Cdc7 kinase. Dbf4 is the regulatory and Cdc7 the catalytic subunit of this kinase, which functions in activating replication origins. When a replication fork is damaged, the checkpoint response activates Rad53, which binds transiently, yet specifically, to Dbf4 and this, in turn, inhibits the activity of Dbf4-Cdc7. The outcome of this interaction prevents activation of late origins during replication stress. Our laboratory has extensively characterized the Dbf4-Rad53 interaction, thereby providing an excellent system to probe new ways to stabilize a weak protein complex. The N-terminal forkhead associated (FHA) domain of Rad53 mediates the interaction with the BRCA-1 C-terminus (BRCT) domain of Dbf4. FHA and BRCT domains are modular domains, in which their N- and C-termini lie on the same face. Thus, we decided to stabilize the Dbf4-Rad53 complex using linkers of different lengths to join the two proteins. We generated four different Dbf4-linker-Rad53 fusions and characterized them biochemically, as well as structurally using small angle X-ray scattering. Only one of the fusions yielded crystals suitable for crystallographic analysis, and we solved the structure by molecular replacement. The four copies of the fusion in the asymmetric unit showed identical Dbf4-Rad53 interfaces that were in agreement with previous studies characterizing the Dbf4-Rad53 interaction. Importantly, the interaction in the crystal structure occurs inter- rather than intra-molecularly suggesting that the linker increases local protein concentration but does not impose complex formation. In a broader sense, our work reveals general trends that can be used to design linkers to capture weak protein complexes.
Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.
Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,001 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,003 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,006 | 0,004 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».