Biophysical characterization and crystallization of the membrane protein Etk
Notice bibliographique
Résumé
The inner membrane protein E. coli tyrosine kinase (Etk) is part of a large protein complex that assembles and exports capsular polysaccharide (CPS) in Gram-negative bacteria. Etk interacts with an outer membrane protein channel, YccZ (1), and regulates CPS export through autophosphorylation of a tyrosine cluster in its C-terminal tail. Previous work resulted in the structure of the isolated Etk C-terminal kinase domain (2). In the present study, the full-length protein has been purified and characterized in vitro. When purified in n-dodecyl-β-D-maltoside (DDM), Etk full length retains autophosphorylation activity, but is not suitable for crystallization because it severely aggregates and degrades. Using the main degradation product, a truncation containing the N-terminal domain (interacts with YccZ) and both transmembrane helices was designed. Truncated Etk does not further degrade and exists as a mixture of monomers and dimers when solubilized by five detergents as determined by size-exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation. Crystals have been successfully grown when the protein is solubilized in DDM or n-decyl-β-D-maltoside (DM). The most promising crystals (DDM, 0.1 M MES pH 6.0, 1-5% PEG 3000, 20-30% PEG 200) have been reproduced and optimized with the assistance of a colorimetric assay (3). This assay relies on a reaction between 2,6-dimethylphenol, sulfuric acid, and the sugar head group of certain detergents to accurately quantify detergent in crystallization samples with minimal sample loss. Additive screening also revealed that MgCl2 improves crystallization. Optimization of this crystallization condition has significantly improved reproducibility of these crystals, but x-ray diffraction is limited to 6.5 Å. Current work is focused on reproducing and optimizing a second crystallization lead (DM, 0.1 M KH2PO4 pH 7.5, 32% PEG 400, 0.1 M KCl).
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».