Le rôle des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 et du facteur de transcription anti-oxydant Nrf2 dans l'effet protecteur de la thermotolérance (40°C)

L'hyperthermie (41-45°C), ou thermothérapie, est un traitement contre le cancer utilisé en combinaison avec la radio- et la chimiothérapie. L'hyperthermie créé des réactions de stress dans les cellules cancéreuses qui mènent à leur mort par apoptose. Malgré de nombreux progrès dans son utilisation clinique, les mécanismes impliqués dans la réponse cellulaire à l'hyperthermie ne sont pas encore élucidés. La thermotolérance est une réponse adaptative qui apparait en réponse à l'hyperthermie. Elle permet l'induction de défenses (protéines de choc thermique, réponse aux protéines mal-repliées (UPR), antioxydants) qui permettront à la cellule de survivre un stress subséquent de choc thermique aigu. La thermotolérance pourrait donc représenter un obstacle aux traitements par hyperthermie, mais son effet est transitoire et n'a donc pas d'impact sur les traitements. La thermotolérance peut être induite suite à une exposition courte (<1h) à de fortes températures (42-45°C) ou suite à une exposition longue (≥3h) à des températures modérées (39-40°C). Ce deuxième type de thermotolérance peut être induit lors d'un état fiévreux, la fièvre étant un effet secondaire courant de l'hyperthermie. Cette thermotolérance modérée est encore peu étudiée et mal comprise. Les deux objectifs principaux de cette étude sont (1) de mieux comprendre les mécanismes de mort cellulaire induits par hyperthermie (42-43°C), notamment par la voie de l'apoptose mitochondriale et les protéines de la famille Bcl-2, ainsi que l'impact de la thermotolérance (40°C) sur cette voie, et (2) d'étudier l'implication possible du facteur de transcription antioxydant « nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 » (Nrf2) dans l'induction de la thermotolérance. L'objectif premier est de déterminer la réponse des protéines de la famille Bcl-2 impliquées dans la voie apoptotique mitochondriale lors de chocs thermiques intenses (42-43°C) ou modérés (40°C). En effet, bien que l'implication des protéines Bcl-2 dans l'induction de l'apoptose soit claire, leur réponse à l'hyperthermie est méconnue. L'expression de diverses protéines pro-apoptotiques (Bax, Bak, Puma et Noxa) et anti-apoptotiques (Bcl-2 et Bcl-xL) de cette famille a donc été étudiée par Western Blot. L'hyperthermie (42-43 °C) diminue l'expression totale et mitochondriale de Bcl-2 et Bcl-xL et augmente l'expression mitochondriale de Bax, Bak, Puma et Noxa. Ce débalancement par l'hyperthermie de l'équilibre au sein de la famille de protéines Bcl-2 s'effectue donc en faveur de ses membres pro-apoptotiques, menant ensuite à l'augmentation de l'activité des caspases-9 et -3 et à la condensation de la chromatine, marqueur physique de l'entrée en apoptose des cellules. La thermotolérance (40°C) annule ces effets pro-apoptotiques de l'hyperthermie en rétablissant le niveau basal d'expression de ces protéines Bcl-2, et permet donc de diminuer l'activité des caspases-9 et -3 et le taux global d'apoptose chez les cellules exposées à un choc thermique à 42-43°C. L'inhibiteur de Bcl-2 et Bcl-xL, ABT-737, exacerbe les effets de l'hyperthermie, aboutissant donc à un taux d'apoptose plus élevé que sans inhibiteur. Des inhibiteurs des membres anti-apoptotiques de Bcl-2 sont déjà développés en clinique; leur utilisation en combinaison avec l'hyperthermie pourrait donc être envisagée afin d'améliorer l'efficacité de cette dernière. En inhibant les protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2, l'ABT-737 cause une diminution de l'effet protecteur de la thermotolérance, prouvant ainsi l'implication de ces protéines dans la mise en place de cette réponse adaptative. La thermotolérance protège donc les cellules contre l'apoptose induite par les chocs thermiques en modulant des effecteurs de la voie mitochondriale. Le deuxième objectif est de déterminer l'implication du facteur de transcription antioxydant Nrf2 dans l'induction de la thermotolérance (40°C). II a déjà été prouvé que la thermotolérance (40°C, 3h) induit l'augmentation de la présence d'antioxydants (manganèse superoxyde dismutase (MnSOD), glutamate-cystéine ligase (GCL), glutathion, catalase) dans les cellules (Pallepati et Averill-Bates, 2010). Nous avons donc voulu évaluer si cette augmentation pouvait être liée à l'activation du facteur de transcription Nrf2, qui a pour cible de nombreux gènes codant pour des antioxydants tels la catalase. L'exposition des cellules à 40°C pendant 30 à 60 min permet l'augmentation des espèces réactives de l'oxygène (ERO) tels que superoxyde, peroxydes et nitrique oxyde. Après 1h à 40°C, on observe un pic d'expression de Nrf2, qui se traduit par l'augmentation de l'activité de la catalase à partir de 1h. L'induction de la thermotolérance passerait donc par une augmentation précoce des ERO qui déclencherait ensuite la voie antioxydante de Nrf2 afin d'activer la production d'antioxydants. L'inhibition de Nrf2 par l'utilisation d'un shARN est capable de diminuer l'effet protecteur de la thermotolérance (40°C, 3h) à l'encontre de l'apoptose induite par un choc thermique (42°C, 3h), alors que l'augmentation de l'expression de Nrf2 par l'oltipraz permet d'augmenter cet effet protecteur. Les ERO et le facteur de transcription Nrf2 sont donc impliqués dans la mise en place des réponses de survie caractéristiques de la thermotolérance à 40°C. En conclusion, cette étude permet d'ajouter aux connaissances sur les mécanismes apoptotiques induits par l'hyperthermie (42-43°C). Elle permet également de mieux comprendre l'effet protecteur de la thermotolérance, réponse adaptative induite par un stress thermique modéré (40°C). Les éléments précoces d'induction de la thermotolérance ont notamment été élucidés. Ces connaissances pourront permettre d'envisager une utilisation de la thermotolérance afin de traiter des maladies liées aux stress cellulaires. \n______________________________________________________________________________ \nMOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : hyperthermie, thermotolérance, protéines Bcl-2, Nrf2, espèces réactives de l'oxygène, antioxydant

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