Expression, Purification, and Properties of a Human Arachidonoyl-Specific Isoform of Diacylglycerol Kinase
Notice bibliographique
Résumé
Diacylglycerol kinase ε (DGKε) catalyzes the phosphorylation of diacylglycerol, producing phosphatidic acid. DGKε demonstrates exquisite specificity for the acyl chains of diacylglycerol. This contributes to the enrichment of particular acyl chains within the lipids of the phosphatidylinositol cycle. Phosphatidylinositol is highly enriched with 1-stearoyl-2-arachidonoyl, which is important for maintaining cellular health. Dysregulation of DGKε perturbs lipid signaling and biosynthesis, which has been linked to epilepsy, Huntington's disease, and heart disease. Recessive loss-of-function mutations in the DGKε gene cause atypical hemolytic uremic syndrome. Because DGKε has never been purified, little is known about its molecular properties. We expressed human DGKε and a truncated version lacking the first 40 residues (DGKεΔ40) and purified both proteins to near homogeneity using nickel affinity chromatography. Kinase activity measurements showed that both purified constructs retained their acyl chain specificity for diacylglycerol with an activity level comparable to that of N-terminally FLAG epitope-tagged forms of these proteins expressed in COS7 cells. Both constructs lost activity upon being stored, particularly upon freezing and thawing, which was minimized by the addition of glycerol. Circular dichroism revealed that DGKε and DGKεΔ40 both contain significant amounts of α-helical and β structure and exhibit biphasic thermal denaturations. The loss of secondary structure upon heating was irreversible for both constructs, with relatively little effect of added dioleoylphosphatidylcholine. The addition of 50% glycerol stabilized both constructs and facilitated refolding of their secondary structures after heating. This is the first successful purification and characterization of DGKε's enzymatic and conformational properties. The purification of DGKε permits detailed analyses of this unique enzyme and will improve our understanding of DGKε-related diseases.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».