Successful optimization of CRISPR/Cas9-mediated defined point mutation knock-in using allele-specific PCR assays in zebrafish
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODN) are donor templates for homology-directed repair-based knock-in of point mutations using CRISPR/Cas9. To optimize the efficiency of ssODN-based knock-ins in zebrafish, we developed allele-specific PCR (AS-PCR) assays for introducing point mutations in tp53 , cdh5 and lmna as case studies. In these point mutation strategies we introduced the codon mutations, sgRNA site mutations and restriction sites which can be detected by AS-PCR with the primers matching their respective alleles in combination with a common primer. We employed the anti-sense asymmetric oligo design as the main optimization as well as phosphorothioate oligo modification and also observed that proximity of the mutation site to the Cas9 cut site improves the efficiency when knock-ins into different genes were compared. We improved the efficiencies of two tp53 knock-ins using anti-sense asymmetric ultramer oligos (126-nt in length with homology arms of 36 and 90 nucleotides, anti-sense to the sgRNA) by 3-10 fold, the optimizations which resulted in successful founders for both tp53 knock-ins with transmission rates of 20-40 %. The initially low knock-in efficiency for tp53 mutants was likely due to the distance between the Cas9 cut site and mutations since cdh5 G767S knock-in located at the cut site had much higher founder identification and germline transmission rates. The phosphorothioate oligo modifications was used for a lamin A/C ( lmna ) knock-in strategy and it resulted in 40 % overall improvement in knock-in efficiency and greater knock-in consistency. We also determined that AS-PCR detected false-positive knock-ins which constituted 25-80 % of total in different strategies and developed a workflow to screen out the founders and F1 zebrafish carrying these undesirable modifications. In summary, we provide a complementary set of optimizations for CRISPR/Cas9-based ssODN knock-ins in zebrafish using a novel combination of methods.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,001 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».