Slippage of degenerate primers can cause variation in amplicon length
Notice bibliographique
Résumé
It is well understood that homopolymer regions should be avoided for primer binding to prevent off-target amplification. However, in metabarcoding, it is often difficult to avoid primer degeneracy in order to maximize taxa detection. We here investigate primer binding specificity using different primer sets from several invertebrate metabarcoding studies. Our results indicate that primers frequently bound 1-2 bp upstream in taxa where a homopolymer region was present in the amplification direction. Primer binding 1 bp downstream was observed less frequently. This primer slippage leads to taxon-specific length variation in amplicons and subsequent length variation in recovered sequences. Some widely used primer sets were severely affected by this bias, while others were not. While this variation will only have small impacts on the designation of Operational Taxonomic Units (OTUs) by clustering algorithms that ignore terminal gaps, primer sets employed in metabarcoding projects should be evaluated for their sensitivity to slippage. Moreover, steps should be taken to reduce slippage by improving protocols for primer design. For example, the flanking region adjacent to the 3' end of the primer is not considered by current primer development software although GC clamps in this position could mitigate slippage.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,023 | 0,042 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,003 | 0,004 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,005 | 0,003 |
| Bibliométrie | 0,003 | 0,003 |
| Études des sciences et des technologies | 0,002 | 0,002 |
| Communication savante | 0,003 | 0,002 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,003 |
| Intégrité de la recherche | 0,003 | 0,004 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,004 | 0,006 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».