Visualization of class A GPCR oligomerization by image-based fluorescence fluctuation spectroscopy
Notice bibliographique
Résumé
Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest class of cell surface receptors conveying extracellular information into intracellular signals. Many GPCRs have been shown to be able to oligomerize and it is firmly established that Class C GPCRs (e.g. metabotropic glutamate receptors) function as obligate dimers. However, the oligomerization capability of the larger Class A GPCRs (e.g. comprising the β-adrenergic receptors (β-ARs)) is still, despite decades of research, highly debated. Here we assess the oligomerization behavior of three prototypical Class A GPCRs, the β 1 -ARs, β 2 -ARs, and muscarinic M 2 Rs in single, intact cells. We combine two image correlation spectroscopy methods based on molecular brightness, i.e. the analysis of fluorescence fluctuations over space and over time, and thereby provide an assay able to robustly and precisely quantify the degree of oligomerization of GPCRs. In addition, we provide a comparison between two labelling strategies, namely C-terminally-attached fluorescent proteins and N-terminally-attached SNAP-tags, in order to rule out effects arising from potential fluorescent protein-driven oligomerization. The degree of GPCR oligomerization is expressed with respect to a set of previously reported as well as newly established monomeric or dimeric control constructs. Our data reveal that all three prototypical GPRCs studied display, under unstimulated conditions, a prevalently monomeric fingerprint. Only the β 2 -AR shows a slight degree of oligomerization. From a methodological point of view, our study suggests three key aspects. First, the combination of two image correlation spectroscopy methods allows addressing cells transiently expressing high concentrations of membrane receptors, far from the single molecule regime, at a density where the kinetic equilibrium should favor dimers and higher-order oligomers. Second, our methodological approach, allows to selectively target cell membrane regions devoid of artificial oligomerization hot-spots (such as vesicles). Third, our data suggest that the β 1 -AR appears to be a superior monomeric control than the widely used membrane protein CD86. Taken together, we suggest that our combined image correlation spectroscopy method is a powerful approach to assess the oligomerization behavior of GPCRs in intact cells at high expression levels.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».