A platform for chemical modification of mandelate racemase: characterization of the C92S/C264S and γ-thialysine 166 variants
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Notice bibliographique
Résumé
Mandelate racemase (MR) serves as a paradigm for our understanding of enzyme-catalyzed deprotonation of a carbon acid substrate. To facilitate structure-function studies on MR using non-natural amino acid substitutions, we engineered the Cys92Ser/Cys264Ser variant (dmMR) as a platform for introducing Cys residues at specific locations for subsequent covalent modification. While the highly reactive thiol of Cys furnishes a site for chemical modification, site-specificity requires that other Cys residues be non-reactive or replaced by a non-reactive amino acid, especially if chemical modification is conducted under denaturing conditions. The catalytic efficiency of dmMR is reduced only ~2-fold relative to wild-type MR, making dmMR a viable platform for the site-specific introduction of Cys. As an example, the inactive Lys166Cys variant of dmMR was treated with ethylenimine under denaturing conditions to replace the Brønsted acid-base catalyst Lys 166 with the non-natural amino acid γ-thialysine. Comparison of the pH-activity profiles of dmMR and the active γ-thialysine variant revealed a reduction in the pKa for the side chain amino group of ~0.4 units for the latter variant. Unlike wild-type MR for which diffusion is partially rate-limiting, dmMR and the γ-thialysine variant showed no dependence on the solvent viscosity suggesting that the chemical step is fully rate-limiting.
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Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
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