Abstract 346: A Standard Flow Cytometry Protocol for Assessing Human Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocyte Identity by Troponin Positivity
Notice bibliographique
Résumé
Directed differentiation of human pluripotent stem cells (hPSC) into cardiomyocytes (hPSC-CM) offers an inexhaustible supply of cells for basic science research and translational applications. However, despite significant advancements in defining the factors most critical for differentiation, the resulting cultures remain a heterogeneous mixture of cells. Ultimately, as heterogeneity can pose challenges to interpreting functional data, the ability to accurately and precisely assess cell identity in differentiation cultures is paramount to well-defined and reproducible studies. To date, a standardized flow cytometry protocol that is broadly accepted among laboratories has not been established for assessing cell type heterogeneity within hPSC-CM cultures, posing challenges to evaluating outcomes generated among laboratories and studies. A survey of studies published over the past seven years (1/2010-10/2017) reveals the wide range of antibodies and experimental conditions reported for flow cytometry-based assessment of hPSC-CM. Although our literature survey revealed that a preponderance of studies relied on TNNT2 as a marker of cardiomyocyte identity, TNNI3 is more specific to cardiomyocytes than TNNT2 throughout development. We applied targeted mass spectrometry to confirm the presence of TNNI3 in our hPSC-CM. We then investigated five commercially available anti-TNNI3 and three sample preparation techniques for use in the assessment of heterogeneity of hPSC-CM cultures by flow cytometry. Results demonstrate two of the five anti-TNNI3 clones appear suitable for marking hPSC-CM and reveal differential susceptibility of antibody clones to sample preparation conditions. To further test the rigor and utility of our flow cytometry protocol, it was shared with two collaborating laboratories and applied to heterogeneous mixtures of positive and negative cell types. Results from these two laboratories demonstrate the protocol successfully distinguishes positive and negative cell types similarly, despite using different cell lines and differentiation protocols. We propose a workflow for establishing the fit-for-purpose use of antibodies and a standard protocol for assessing hPSC-CM identity by troponin positivity.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,003 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,002 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,001 |
| Bibliométrie | 0,004 | 0,002 |
| Études des sciences et des technologies | 0,002 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,002 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,030 | 0,015 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».