Determinação de microRNAs circulantes em plasma de pacientes jovens e de meia idade com câncer de mama

e Liliane.Ao Dr. René A.C. Vieira do Hospital do Câncer de Barretos, por ser tão prestativo e comprometido com o envio de amostras de plasma.Ao Setor de Mecanismo de Lípides, do Instituto do Coração (Incor), em especial à Dra Débora, por permitir a utilização da ultracentrífuga.À Dra.Michele e ao Dr. Edson do A.C. Camargo por cederem e auxiliarem na utilização do Nanosight.À Dra.Diana Noronha e a Dra.Andreia Otake pelas contribuições na banca de qualificação.À Cristiane e Maiara por serem tão atenciosas e comprometidas em ajudar os alunos nas questões administrativas da pós graduação.Aos funcionários do Centro Translacional de Pesquisa em Oncologia.Aos colegas de laboratório, em especial Gláucia, Lívia, Isabela, Alexis, Rose, Jânio, Mayara e Renata.Foram todos essenciais nesses anos passados juntos, o carinho e amizade que compartilhamos em momentos profissionais e pessoais seguirá sempre comigo.Agradecimento especial a todas as pacientes participantes do estudo, que mesmo em um momento tão delicado e muitas vezes obscuro, concordaram em ceder amostras para o Biobanco e acreditar na ciência feita no ICESP.A vocês, todo meu carinho, admiração e desejo de que a luz prevaleça em seus caminhos!E ao apoio da CAPES, pela bolsa de mestrado recebida."The scariest moment is always just before you start."Stephen King RESUMO Duran, A. Determinação de microRNAs circulantes em plasma de pacientes jovens e de meia idade com câncer de mama [dissertação].Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2019.INTRODUÇÃO: Câncer de mama em pacientes jovens é uma condição rara (4% dos casos) e parece apresentar um pior prognóstico para essas pacientes quando comparado com as mais velhas.Um estudo anterior do grupo, comparou a expressão de microRNAs (miRs) entre tumores de pacientes jovens (≤35 anos) e de meia-idade (50-69 anos) e foram encontradas diferenças em 8 miRs (miR-9, miR-106a, miR-106b, miR-18b, miR-210, miR-33b, miR-518a-3p and miR-372).Nosso objetivo principal foi verificar se a diferença de expressão encontrada no tumor está refletida também no plasma, comparando a expressão desses 8 miRs circulantes entre dois grupos de idade com câncer de mama ductal invasivo, luminal e baixo risco de mutação em BRCA1/2.MÉTODOS: Foram realizadas consultas a prontuários das pacientes admitidas no Serviço de Mastologia do Instituto do Câncer do Estado de São Paulo (ICESP) (Abril/2016 até Abril/2018) e selecionadas amostras de plasma de pacientes jovens (GJ com ≤35 anos) e de pacientes de meia-idade (GMI com 50-69 anos).No GJ também foram incluídas pacientes do Hospital do Câncer de Barretos com o mesmo diagnóstico.Essas pacientes possuíam diagnóstico confirmado de carcinoma mamário ductal invasivo, luminal (A, B ou luminal HER-2+), sem histórico familiar de câncer de mama com amostras coletadas antes de qualquer tipo de tratamento.Foi realizada extração de RNA total dessas amostras de plasma e feita a determinação de expressão dos 8 miRs por meio de real-time PCR (qPCR) e comparada entre os grupos de idade.Para determinar se esses miRs eram encontrados também presentes dentro de vesículas extracelulares (VEs), estas foram isoladas por ultracentrifugação e quantificadas por Nanosight e o RNA contido nas VEs foi extraído e a expressão dos miRs foi determinada por qPCR.Os resultados foram analisados usando o teste de Mann-Whitney.RESULTADOS: Foram selecionadas amostras de plasma de 24 pacientes do GJ, (15 do ICESP e 9 do Hospital do Câncer de Barretos) e de 21 pacientes do GMI.Nessas amostras, dos 8 miRs avaliados, 6 foram encontrados circulantes e apenas dois (miR-372 e miR-518a-3p) não apresentaram expressão em nenhuma amostra.O cálculo da expressão relativa foi realizado com duas possibilidades de combinação de miRs como normalizadores (miR-18b e miR-21; miR-18b e miR-425), conforme resultado encontrado utilizando o programa Normfinder e por meio do cálculo de ΔCt/Desvio Padrão, respectivamente.E, em ambas condições, o miR-9 foi detectado com maior nível de expressão nas pacientes do GJ quando comparado com a expressão das pacientes do GMI (p= 0,03 e p= 0,01).Na análise de genes-alvo desse miR, foi observado que as principais vias reguladas estão relacionadas principalmente com motilidade celular, regulando genes envolvidos em importantes vias como ILK e transição epitéliomesênquima.Os demais miRs circulantes não apresentaram diferenças de expressão entre os grupos de idade.Também não houve diferença na quantidade de VEs encontradas no plasma (p= 1,0).A expressão dos 8 miRs também foi avaliada nas amostras de VEs isoladas e foi observado que o miR-106a, embora presente em todas as amostras de plasma como um miR circulante, não é transportado dentro das VEs, enquanto o miR-9, miR-106b e o miR-18b foram encontrados presentes em todas as amostras de VEs avaliadas.CONCLUSÕES: os tumores de pacientes jovens parecem apresentar determinadas características biológicas diferentes, como a expressão do miR-9, importante miR relacionado principalmente com invasão e associado com um pior prognóstico.Um maior acompanhamento dessas pacientes será importante para determinar a real influência desse miR na progressão tumoral e compreender as diferenças biológicas encontradas nos tumores de mama jovem.

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