Efficient Generation of Large‐Fragment Knock‐In Mouse Models Using 2‐Cell (2C)‐Homologous Recombination (HR)‐CRISPR
Notice bibliographique
Résumé
Abstract Generating large‐fragment knock‐ins, such as reporters, conditional alleles, or humanized alleles, directly in mouse embryos is still a challenging feat. We have developed 2C‐HR‐CRISPR, a technology that allows highly efficient (10‐50%) and rapid (generating founders in 2 months) targeting of large DNA fragments. Key to this strategy is the delivery of CRISPR reagents into 2‐cell‐stage mouse embryos, taking advantage of the high homologous recombination activity during the long G 2 cell cycle phase at this stage. Furthermore, by exploiting a Cas9–monomeric streptavidin (Cas‐mSA) and biotinylated PCR template (BioPCR) system to localize the repair template to specific double strand breaks, the efficiency can be further improved to up to 95%. Here we provide a procedure to generate large‐fragment knock‐in mouse models using 2C‐HR‐CRISPR. We first describe the principles for designing single guide RNAs and repair templates but refer to published manuscripts and protocols for molecular cloning methods or commercial sources for these reagents. We then describe two unique aspects of 2C‐HR‐CRISPR that are critical for success: (1) production of the CRISPR reagents for 2C‐HR‐CRISPR, particularly for applying the Cas9‐mSA/BioPCR method, and (2) microinjection of mouse embryos at the 2‐cell stage. © 2020 by John Wiley & Sons, Inc. Basic Protocol 1 : Single guide RNA and repair template design Basic Protocol 2 : Preparing reagents for 2C‐HR‐CRISPR Basic Protocol 3 : Microinjecting 2‐cell‐stage mouse embryos
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,000 | 0,000 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».