Comparison of two glycoengineering strategies to control the fucosylation of a monoclonal antibody
Notice bibliographique
Résumé
Core fucosylation of an Fc N-linked glycan affects antibody effector functions, as the absence of fucose increases the antibody dependent cell cytotoxicity (ADCC) response with increased binding to the Fcγ receptors. The work presented here compares two different approaches to incrementally reduce core fucosylation of a camelid heavy chain antibody, EG2-hFc expressed in CHO cells which targets the EGFR receptor. The first method uses a fucosyltransferase (FUT) inhibitor, 2- fluoro peracetylated fucose (2FF), which was added to cell cultures expressing the EG2-hFc antibody in increasing concentrations up to 50μM. At this concentration there was no observed effect on cell growth. Glycan analysis was performed on antibodies collected from culture samples using HILIC-HPLC. The inhibitor reduced total fucosylation from 80% to 17.5% at 20μM 2FF. The second method involved transfecting the EG2-hFc producing cells with a prokaryotic GDP- 6-deoxy-D-lyxo-4-hexulose reductase (RMD) gene in order to deflect the fucose de novo pathway into producing rhamnose which is not incorporated into a glycan. Stable clones from transfected pools were isolated following flow cytometry using the green fluorescent protein (GFP) marker which was co-expressed with the RMD gene. High expressing RMD clones reduced the fucosylation of the antibody glycan to as low as 16%. The addition of 2FF to cultures of these RMD clones reduced the fucosylation level even further to 3% of the antibody glycan. An incremental increase in fucosylation was obtained by step-wise addition of fucose (up to 1 mM) to the RMD cells, in which the fucosylation level increased to a maximum of 87%. We also used ESI-MS to analyze the fucosylation pattern of EG2-hFc with addition of increasing concentrations of 2FF. This showed that 2FF inhibits the addition of fucose in a concentration- dependent and specific manner with the inhibition of fucose occurring one fucose at a time. Control cultures showed the presence of a predominant peak indicating two fucose moieties per antibody. As the 2FF inhibitor concentration was increased peaks corresponding to one fucose per antibody and non-fucosylated antibody predominated with a gradual decrease of the 2 fucose peak to insignificance at 15 μM 2FF.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,000 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,001 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,001 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».