Rapid Generation of Human Neuronal Cell Models Enabling Inducible Expression of Proteins-of-interest for Functional Studies

CRISPR-Cas9 technology has transformed the ability to edit genomic sequences and control gene expression with unprecedented ease and scale. However, precise genomic insertions of coding sequences using this technology remain time-consuming and inefficient because they require introducing adjacent single-strand cuts through Cas9 nickase action and invoking the host-encoded homology-directed repair program through the concomitant introduction of large repair templates. Here, we present a system for the rapid study of any protein-of-interest in two neuronal cell models following its inducible expression from the human AAVS1 safe harbor locus. With lox-flanked foundation cassettes in the AAVS1 site and a tailor-made plasmid for accepting coding sequences-of-interest in place, the system allows investigators to produce their own neuronal cell models for the inducible expression of any coding sequence in less than a month. Due to the availability of preinserted enhanced green fluorescent protein (EGFP) coding sequences that can be fused to the protein-of-interest, the system facilitates functional investigations that track a protein-of-interest by live-cell microscopy as well as interactome analyses that capitalize on the availability of exquisitely efficient EGFP capture matrices., [摘要] CRISPR-Cas9技术以前所未有的简便性和规模改变了编辑基因组序列和控制基因表达的能力。但是，由于需要引入相邻的单链，因此使用该技术进行精确的基因组编码插入仍然很耗时且效率低下。通过减少Cas9切口酶的作用并通过同时引入大型修复模板来调用宿主编码的同源性指导的修复程序。在此，我们提出了一种系统，用于在其诱导后的两个神经元细胞模型中快速研究任何目的蛋白该系统可从人类AAVS1 安全港基因座表达，在AAVS1 位点具有lox侧翼的基础盒和定制的质粒以接受感兴趣的编码序列，该系统使研究人员能够为诱导型产生自己的神经元细胞模型任何编码表达序列不到一个月的时间。由于可用性Preinserted 增强型绿色的Fluo 可以与目标蛋白质融合的最新蛋白质（EGFP）编码序列，该系统可帮助功能研究通过活细胞显微镜以及利用非常有效的可用性进行的相互作用组分析来跟踪目标蛋白质EGFP捕获矩阵。[背景] 工程化细胞模型和生物体基因组的能力在研究和靶向治疗方面具有巨大潜力。随着CRISPR-Cas9技术的出现，精确基因组工程的效率大大提高，有用的试剂正在网上尽管取得了这些进展，但仍然缺乏基于细胞的体外研究神经逻辑疾病的范例，这阻碍了该领域的发展步伐，而CRISPR-Cas9介导的同源指导修复（HDR）现在可以容易地用于产生基因敲除模型或敲入小的转基因片段，整合较大片段的目标仍然提出了相当大的挑战（Devkota，2018）。在我们自己的工作中，我们通常希望通过研究蛋白质的亚细胞定位和蛋白质-蛋白质相互作用来了解蛋白质的功能。为此，如果神经元细胞模型可以配备可提供瞬时表达的诱导系统，这将有所帮助控制目的蛋白的表达并促进其可视化和捕获。不久前，这种需求将要求表达盒的稳定转染或慢病毒转导，这种方法可能会导致不可预测的混杂效应。 CRISPR-Cas9提供了替代策略以精确的方式完成此任务，但是这些方法仍然很耗时，并且需要大量的资源和专业知识投资。为了解决这一未被满足的需求，我们寻求发展资源，可以快速，灵活集成大量诱导表达盒引入的AAVS1 人类安全港基因座（DeKelver 等，2010）几种神经细胞模型。稳定插入AAVS1 轨迹与病毒整合相反，选择该基因是为了避免转基因沉默和插入诱变，即与非定向转基因插入相关的臭名昭著的混杂因素。为了最大程度地提高灵活性和速度，该系统围绕两个基因组编辑步骤构建。使用CRISPR-Cas9介导的HDR继之以选择阳性克隆非常耗时且不确定，但我们已经在3种可共享的细胞系中实现了这一目标。第二步，依赖于Cre 重组酶介导的表达盒的交换相对容易实现和快速，因为它可以随后进行基于嘌呤霉素的阳性克隆选择。 更具体地说，采用成对的Cas9切口酶CRISPR策略来提高靶向特异性并最小化脱靶效应（Ran 等人，2013），用于插入包含一对lox位点的基础盒（FC）。在人类遗传安全港AAVS1 基因座的内含子1中侧接一个G418抗性标记，同时构建了一个约7 kb的诱导表达质粒（IEX）.IEX中的表达盒两侧是相容的lox位点和突出的元件设计用于接受插入并控制任何目的编码序列的表达（图1 ）。更具体地说，IEX促进了无启动子的嘌呤霉素抗性标记，反向反式激活子（rtTA 3 ）和与之融合的EGFP标签蛋白的-利益插入位点。有了这种安排，RtTA3设计用于驱动诱导表达的EGFP融合蛋白的兴趣是在控制的TREtight 诱导启动子。 有了这些工具，就可以通过三个简单的步骤生成用于诱导表达与EGFP融合的目的蛋白的新型细胞模型：将目标蛋白质的编码序列插入IEX质粒。将IEX质粒和编码Cre 重组酶的质粒瞬时共转染到配备有一个或两个FC的亲本细胞中。通过嘌呤霉素选择或荧光激活细胞分选（FACS）选择稳定的整合克隆。 该系统除了易于操作和提高速度外，还可以将插入的拷贝数限制为两个，分别对应于人类基因组中存在的两个AAVS1 等位基因。该系统还可以对几种蛋白质进行比较分析，因为其设计可确保可以并排生成编码不同目标蛋白的细胞，不需要任何特殊资源，除了人cDNA文库和用于扩增并将给定编码序列插入IEX盒中的相应引物外。 EGFP感兴趣的蛋白的编码序列不仅提供了进行活细胞成像的能力，而且EGFP标签还允许通过GFP 纳米阱技术对融合蛋白进行高亲和力纯化，以研究蛋白-蛋白相互作用（Rothbauer 等等，2008）。 我们最近将该系统应用于几种人类神经元细胞模型中的TAU蛋白和BAG5的研究，包括ReN VM人类神经祖细胞，这些细胞可以分化为神经细胞和神经胶质细胞的共培养物（Donato et al。，2007）。研究导致我们发现TAU和BAG5的野生型与突变形式之间的蛋白质-蛋白质相互作用之间存在细微的差异（图1 ）。本文旨在共享这些资源并促进其适应其他蛋白质的研究感兴趣的 D：\重新格式化\ 2020-3-2 \ 1902994--1381 Gerold Schmitt-Ulms 846733 \图jpg \图1 rev.jpg1.设计图中AAVS1 嵌入式系统对于诱导型表达蛋白质的感兴趣。阿。CRISPR-Cas9 切口酶介导的插入基金会纸盒（FC）向AAVS1 安全港。乙编码序列的感兴趣至可诱导中。插入。表达质粒（IEX）ç 。反向四环素控制的反式激活（RTTA 3 ）在添加多西环素细胞培养基-介导的基因表达蛋白的感兴趣中。d 实施例1 :.并行诱导的野生型和P301L突变体TAU融合到C-末端EGFP在的ReN ..细胞的抗体针对β-肌动蛋白充当上样对照ë 实施例2：侧由端感应N-末端EGFP -标记的野生型或突变体（DARA）BAG5表达EGFP的细胞仅在此分析中用作其他对照。

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