Investigating the stability of nitric oxide synthase quaternary structure to denaturant and temperature
Notice bibliographique
Résumé
A limitation to investigations of homodimeric protein dissociation is that the signals produced from methods such as fluorescence and circular dichroism represent both dissociation and protein unfolding that may be occurring simultaneously within a sample.Although size exclusion chromatography examines the state of a protein's quaternary structure, complicated overlapping peaks representative of oligomer and monomer can result.To address these limitations the mixed dimer system has been adopted to investigate the dissociation of a homodimeric protein.A mixed dimer is a species in which each subunit of a homodimeric protein is associated with a different affinity tag.The two tags used are the His 6 -tag and the Glu 7 -tag.Such a mixed dimer will bind to a metal chelating column such as Ni-NTA so long as the dimer is intact.Denaturant-or temperature induced dimer dissociation can be detected by the amount of Glu 7 -tagged subunit present in the unbound fraction after the protein is passed over an Ni-NTA resin.SDS PAGE and densitometry assess the amount of Glu 7 -tagged subunit present in those unbound fractions.The experimental conditions necessary to implement this method were developed, and then applied to mammalian inducible nitric oxide synthase (iNOS) and Staphylococcus aureus NOS (SaNOS).With respect to both urea and temperature, the stability of SaNOS is higher than that of iNOS in spite of the bacterial enzyme having a much smaller dimer contact surface.We have also used the mixed dimer method to estimate an equilibrium dissociation constant (K D ) for iNOS dissociation of no greater than 2.3M.This value is compared to the results obtained for iNOS by analytical ultracentrifugation, which can characterize protein complexes and their stoichiometry.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction distillée sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Apprise à partir de 10 348 étiquettes directes de Codex et de 10 348 étiquettes directes de Gemma. Le mode candidate est l'union des têtes enseignantes seuillées; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont ni des étiquettes humaines ni des étiquettes directes de modèles de pointe.
Scores Codex et Gemma par catégorie
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,000 | 0,000 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,001 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,000 |
| Communication savante | 0,000 | 0,000 |
| Science ouverte | 0,000 | 0,000 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,001 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,000 | 0,000 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule tête enseignante, pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».