Rapid electrotransfer probing for improved detection sensitivity in in-gel immunoassays
Notice bibliographique
Résumé
Protein electrotransfer in conventional western blotting facilitates detection of size-separated proteins by diffusive immunoprobing, as analytes are transferred from a small-pore sizing gel to a blotting membrane for detection. This additional transfer step can, however, impair detection sensitivity through protein losses and confound protein localization. To overcome challenges associated with protein transfer, in-gel immunoassays immobilize target proteins to the hydrogel matrix for subsequent in-gel immunoprobing. Yet, detection sensitivity in diffusive immunoprobing of hydrogels is determined by the gel pore size relative to the probe size, and in-gel immunoprobing results in (i) reduced in-gel probe concentration compared to surrounding free-solution, and (ii) slow in-gel probe transfer compared to immunocomplex dissociation. Here, we demonstrate electrotransfer probing for effective and rapid immunoprobing of in-gel immunoassays. Critically, probe (rather than target protein) is electrotransferred from an inert, large-pore 'loading gel' to a small-pore protein sizing gel. Electric field is used as a tuneable parameter for electromigration velocity, providing electrotransfer probing with a fundamental advantage over diffusive probing. Using electrotransfer probing, we observe 6.5 ± 0.1× greater probe concentration loaded in-gel in ∼82× time reduction, and 2.7 ± 0.4× less probe concentration remaining in-gel after unloading in ∼180× time reduction (compared to diffusive probing). We then apply electrotransfer probing to detect OVA immobilized in-gel and achieve 4.1 ± 3.4× greater signal-to-noise ratio and 30× reduction in total immunoprobing duration compared to diffusive probing. We demonstrate electrotransfer probing as a substantially faster immunoprobing method for improved detection sensitivity of protein sizing in-gel immunoassays.
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Comment cette classification a été obtenuedéplier
Prédiction machine sur la base complète
Imitation des enseignantsNi prévalence calibrée, ni vérité terrain. Validation humaine à venir. Le volet Gemma est une étiquette directe du modèle pour chaque travail de la base, lue sur la notice réduite au titre. Le volet Codex est un classifieur appris des 10 348 étiquettes directes de Codex et calibré sur les taux pondérés de l'échantillon; les champs sans appui suffisant ne portent aucun appel Codex. Le mode candidate est l'union des deux volets; le consensus est leur intersection. Ces sorties portent le statut machine_predicted_unvalidated et ne sont pas des étiquettes humaines.
Scores du classifieur distillé par catégorie (deux têtes)
| Catégorie | Codex | Gemma |
|---|---|---|
| Métarecherche | 0,001 | 0,002 |
| Méta-épidémiologie (sens strict) | 0,001 | 0,001 |
| Méta-épidémiologie (sens large) | 0,001 | 0,000 |
| Bibliométrie | 0,000 | 0,000 |
| Études des sciences et des technologies | 0,000 | 0,001 |
| Communication savante | 0,001 | 0,001 |
| Science ouverte | 0,001 | 0,001 |
| Intégrité de la recherche | 0,001 | 0,002 |
| Charge utile insuffisante (le modèle a refusé de juger) | 0,002 | 0,001 |
Scores machine (provisoires)
Les deux têtes enseignantes du modèle étudiant, lues sur ce travail. Un score ordonne la base pour la relecture; il n'affirme jamais une catégorie, et le statut de validation accompagne chaque rangée tel quel.
Scores de référence d'un modèle non mature (critères de maturité non atteints, 7 itérations). Un score ordonne; il n'affirme jamais une catégorie.
score_only:v0-immature-baseline · tel quel depuis la passe de notation : score_only signifie que le nombre peut ordonner les travaux, et qu'aucune étiquette de catégorie n'en découleClassification
machine, non validéePrédiction automatique; un appel candidat d’une seule source (Gemma direct ou Codex distillé), pas un consensus.
Le détail, modèle par modèle et score par score, se trouve en fin de page sous « Comment cette classification a été obtenue ».