Enhancing islet transplantation and functionality by the use of complex polymer structures

Il diabete mellito di tipo 1 e una malattia autoimmunitaria che causa la distruzione delle cellule β−pancreatiche secernenti insulina, presenti nel pancreas. Il ripristino della funzione -cellulare puo essere ottenuto mediante il trapianto di isole pancreatiche . Nell’uomo, il fegato e il sito attualmente utilizzato in clinica per il trapianto di isole pancreatiche. Nonostante i significativi miglioramenti indotti dal protocollo Edmonton (che prevede un protocollo immunosoppressivo senza steroidi; ClinicalTrials.gov number, NCT00014911), la capacita di raggiungere l’insulino-dipendenza nei pazienti con diabete di tipo 1 rimane limitata. Molte variabili possono, infatti, compromettere il successo di questa terapia; tra queste si possono citare: i) le procedure di isolamento, purificazione e coltura pre-trapianto; ii) il trapianto stesso, per i processi infiammatori correlati alla meccanica e al sito di impianto (attivazione della cascata coagulativa, IBMIR (Instant Blood-Mediated Inflammatory Reaction), stress meccanico, rilascio di citochine). Come risultato di questi eventi negativi, circa il 75% della massa cellulare trapiantata viene distrutta nei primi minuti dopo l’infusione. Ricreare la niche β-cellulare e la sua struttura 3D pre-trapianto risulta quindi necessario per preservarne la funzionalita e la sopravvivenza a lungo termine. L’utilizzo di biomateriali e una possibile strategia per risolvere alcune di queste problematiche. In letteratura, numerosi sono i lavori (per lo piu’ in modelli murini) riguardanti l’utilizzo di biomateriali per supportare, in un sito extraepatico, il trapianto di isole pancreatiche. Ad ora pero, sono ancora numerose le problematiche incontrate in questo tipo di strategia. Ad oggi, la maggior parte dei biomateriali/strutture utilizzati a questo scopo, principalmente microcapsule, hanno infatti dimostrato numerosi limiti: ridotta sopravvivenza cellulare, fibrosi, mancata rivascolarizzazione del tessuto. Inoltre, alcuni sistemi proposti (specialmente dispositivi intravascolari) richiedono una chirurgia invasiva che quindi non giustifica l’avanzamento della procedura rispetto a quella che costituisce il gold standard di riferimento, cioe l’embolizzazione delle isole nella vena porta. Obiettivo della ricerca oggetto del presente lavoro di dottorato e stato quello di identificare e utilizzare una struttura polimerica multifunzionale (che proteggesse le isole dagli insulti esterni senza impedirne la funzionalita e mimando un microambiente ideale simile al pancreas in toto) per prevenire la perdita di isole, preservandone il piu possibile la funzionalita e aumentandone l’efficacia del trapianto stesso cercando di risolvere i problemi riscontrati impiegando differenti strutture descritte in lavori di letteratura. Per raggiungere lo scopo prefissato, il progetto di tesi si articola nelle seguenti fasi di ricerca: (i) progettazione di una struttura polimerica partendo da un’analisi di letteratura; (ii) identificazione di un nuovo materiale polimerico con proprieta superficiali, chimico-fisiche, meccaniche e di interazione biologica cellulare adatte allo scopo; (iii) sviluppo della struttura utilizzando i materiali identificati e caratterizzazione per valutarne le proprieta chimico-fisiche e meccaniche; (iv) valutazione degli effetti della sterilizzazione sulle caratteristiche chimico-fisiche e meccaniche del materiale; (v) valutazione dell’ interazione biologica in vitro del biomateriale con isole pancreatiche umane e murine (valutandone l’adesione e la funzionalita); (vi) valutazione dell’effettiva funzionalita del supporto realizzato in vivo in modello preclinico murino. Un idrogelo di gelatina reticolata recentemente brevettato presso il Laboratorio di Biomateriali del Politecnico di Milano (PCT / EP2012 / 060277) e risultato un candidato ideale per il supporto delle isole pancreatiche. La caratterizzazione morfologica, chimico-fisica e meccanica precedente svolta ha dimostrato che questo idrogelo possiede proprieta adeguate per essere considerato un ottimo candidato per la coltura insulare. Presenta, infatti, una morfologia ideale per l’attecchimento e l’adesione delle cellule; la sua capacita di rigonfiarsi, permette il caricamento di una quantita ideale di isole pancreatiche che ne permettono il trapianto; la componente viscoelastica e la sua capacita di rispondere agli stress meccanici dimostrano che sia un ottimo candidato per la protezione insulare in sede di impianto. In seguito allo studio della caratterizzazione dell’idrogelo, la fase di studio dell’interazione dell’idrogelo di gelatina con le isole ha permesso di mettere a punto le condizioni di coltura ottimale per le isole stesse sul supporto. Si e osservato come le isole mantenessero la loro struttura 3D nell’idrogelo, fossero vitali e fossero in grado di rispondere agli stimoli esterni. Si e, infatti, dimostrato come le isole, anche nella proposta struttura 3D, fossero in grado di rispondere a variazioni di glucosio, rilasciando insulina. Con l’intento di trasferire il proposto sistema di coltura nella pratica clinica, e stato inoltre dimostrato come due delle tecniche di sterilizzazione piu usate in ambito biomedicale (i.e., gas plasma e ossido di etilene), non alterino la struttura e le caratteristiche morfologiche e meccaniche dell’idrogelo di gelatina. Inoltre, la sterilizzazione, non alterando in nessun modo le caratteristiche chimico-fisiche dell’idrogelo, non ne altera la sua buona interazione con le isole pancreatiche. L’efficacia del supporto tridimensionale, si e poi dimostrata anche in vivo, in un modello murino di trapianto extraepatico di isole pancreatiche. Topi diabetici che hanno ricevuto isole pancreatiche seminate sull’idrogelo di gelatina e trapiantato in sede peritoneale, sono stati infatti in grado di revertire il loro stato di iperglicemia in un tempo piu breve di topi che hanno ricevuto le isole trapiantate liberamente nel peritoneo. In conclusione in questo lavoro di tesi, si e dimostrato come un supporto tridimensionale, nello specifico un idrogelo di gelatina reticolata, sia fondamentale per la sopravvivenza e la funzionalita delle isole pancreatiche sia in vivo che in vitro. L’idrogelo di gelatina ha, infatti, permesso di prevenire la perdita di isole pancreatiche preservandone il piu possibile la funzionalita e aumentandone l'efficacia del trapianto stesso.

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