Multi-omic characterization of Nitrospira moscoviensis- a roadmap to nitrite oxidation

De biogeochemische stikstofcyclus beschrijft de omzetting van stikstof, het meest voorkomende element in de atmosfeer en een vitale bouwsteen van het leven, tussen zijn verschillende oxidatietoestanden.Menselijke invloeden hebben deze cyclus sterk veranderd, met ernstige schade aan onze omgeving op wereldwijde schaal als gevolg, en daarmee de noodzaak van een alomvattend begrip van de betrokken processen en organismen benadrukt.Nitrietoxidatie wordt nog steeds gezien als een "grote onbekende" binnen de stikstofcyclus, ondanks zijn centrale rol op het raakvlak van de aërobe en anaërobe delen van de stikstofcyclus, waar stikstof kan worden vastgehouden in een biologisch beschikbare vorm of verloren kan gaan als gasvormige emissies naar de omgeving.Nitrietoxidatie is de tweede stap van nitrificatie en wordt gekatalyseerd door het diverse functionele gilde van nitriet-oxiderende bacteriën (NOB).Onder de NOB vertegenwoordigt het geslacht Nitrospira de meest diverse en wijdverspreide groep (clade), waarvan leden zijn geïdentificeerd als belangrijke nitrificeerders in veel natuurlijke en door de mens ontworpen ecosystemen.Ondanks de ecologische en biotechnologische relevantie van het geslacht Nitrospira is ons begrip hierover nog steeds beperkt.Het doel van dit promotieonderzoek was ons begrip van Nitrospira te vergroten door het energiemetabolisme en de enzymen die belangrijk zijn voor nitrietoxidatie te bestuderen in het modelorganisme Nitrospira moscoviensis.Een algemene inleiding in de globale stikstofcyclus, het proces van nitrificatie en specifiek nitrietoxidatie, de diversiteit van nitriet-oxiderende bacteriën en de ecofysiologie van Nitrospira wordt beschreven in Hoofdstuk 1.In Hoofdstuk 2 hebben we een kweeksysteem voor N. moscoviensis opgezet in een continu geroerde tankreactor (CSTR).Nitrospira zijn langzaam groeiende bacteriën die zijn aangepast aan lage nitrietconcentraties en waarvan bekend is dat het kweken een moeilijk en tijdrovend proces is.Het opschalen van biomassaproductie door te kweken in een CSTR was een belangrijke voorwaarde voor de biomassa-intensieve methoden die in de volgende hoofdstukken worden toegepast.Deze kweekopstelling maakte een nauwkeurige controle van fysisch-chemische parameters mogelijk en vermeed fluctuerende concentraties van het energiesubstraat nitriet, terwijl continue biomassa-oogst mogelijk was.Op meerdere tijdstippen werd een transcriptoom analyse uitgevoerd om constante genexpressiepatronen, die wijzen op stabiele groeiomstandigheden, te bevestigen.Daarnaast werd de set van kerngenen die actief zijn tijdens nitriet-oxiderende omstandigheden onderzocht.Hiermee werd het tot dusver grotendeels genoomgebaseerde metabole model van Nitrospira verfijnd en versterkt.Hoewel er nieuwe inzichten zijn verkregen door het energiemetabolisme van Nitrospira te bestuderen op basis van genomische en transcriptomische gegevens, kan alleen een beschrijving van het proteoom de aanwezige enzymen in een cel direct beoordelen.In Hoofdstuk 3 presenteren we daarom een uitgebreide proteoomstudie van N. moscoviensis tijdens stabiele autotrofe groei op nitriet.Bovendien werden verschillende hypothesen met betrekking tot de samenstelling van membraancomplexen in Nitrospira onderzocht met behulp van blue-native polyacrylamide gelelektroforese complexoomprofilering.We identificeerden een schijnbaar complex gevormd door verschillende c-type cytochromen die in alle leden van het geslacht Nitrospira zijn geconserveerd.Verder vonden we bewijs in het proteoom voor een eiwitcomplex dat sterk geconserveerd is onder de nitriet-oxiderende geslachten Nitrospira en Nitrospina en anaërobe ammonium-oxiderende bacteriën.Dit complex kan dienen als membraananker voor het nitrietoxidoreductase (NXR) en kan het op die manier verbinden met de ademhalingsketen.Bovendien duidde complexoomprofilering op een extra component in het NXR-complex, een klein oplosbaar eiwit met onbekende functie zonder homologie met een eerder beschreven vermeende NXR-componenten.Van bacteriën van het geslacht Nitrospira werd aangetoond dat ze eenvoudige organische verbindingen gebruiken als alternatieve energiebronnen, wat een grotere metabolische flexibiliteit aantoont die verder gaat dan hun nitrietoxiderende levensstijl.Een beter begrip van de centrale biochemische routes die het Nitrospira-metabolisme aansturen, helpt ons om hun functie in natuurlijke en ontworpen ecosystemen nauwkeurig te voorspellen.In Hoofdstuk 4 presenteren we daarom een metabool model op genoomschaal voor N. moscoviensis en gebruiken we het om de metabole netwerken die de litho-autotrofe en organo-autotrofe groei op formiaat controleren te evalueren met behulp van constrained-based analyses.De modelvoorspellingen werden experimenteel gevalideerd met behulp van 13 C-isotopische tracers gecombineerd met kwantitatieve metabolomics, ter ondersteuning van de eerdere voorspelling van het centrale koolstofmetabolisme in Nitrospira.Bovendien toonden de bevindingen aan dat, in tegenstelling tot modelvoorspellingen, formiaat niet direct kon worden geassimileerd via de reductieve glycineroute, maar diende als koolstofbron via herassimilatie van CO 2 , het product van formiaatoxidatie.Nitrospira-bacteriën bevatten de periplasmatische variant van het NXR-complex, dat ondanks dat het een sleutelenzym om van nitrietoxidatie te leven, relatief weinig is gekarakteriseerd.In Hoofdstuk 5 hebben we de samenstelling van het nitriet oxidatiesysteem in Nitrospira moscoviensis bestudeerd met op polyacrylamide gel gebaseerde methoden en zuivering door middel van kolomchromatografie.We bevestigden de aanwezigheid van een eiwitcomplex in de periplasmatische fractie, dat een alfa-, bèta-en een oplosbare gamma-subeenheid bevatte en vonden bewijs voor een vierde oplosbare subeenheid van 23,5 kDa met een nog onbekende identiteit en functie.Er werden echter ook NXR-complexen gedetecteerd in de membraanfractie, wat wijst op de aanwezigheid van een aan het membraan gehechte NXR-populatie.Bovendien werden verschillende elektronenmicroscopische methodes, immunogold-labeling en driedimensionale celmodellen op basis van cryo-elektronentomografie gebruikt om de lokalisatie van NXR in de cel nader te onderzoeken, wat de grotendeels oplosbare aard van het complex bevestigde.In het algemeen geven de resultaten van dit hoofdstuk aan dat de periplasmatische NXR in twee verschillende vormen voorkomt in N. moscoviensis, wat verder onderzoek vereist, vooral naar de aard van de interactiepunten met het cytoplasmatische membraan.Alles bij elkaar hebben de multi-omische analyses die in dit proefschrift worden gepresenteerd bijgedragen aan een beter begrip van het centrale metabolisme en de eiwitcomplexen die de groei op nitriet van de belangrijke nitrietoxiderende bacterie N. moscoviensis aansturen. NITRIFICATIONNitrifi cation is a key process within the nitrogen cycle.It describes the sequential oxidation of ammonia via nitrite to nitrate, a process mediated by different groups of microorganisms.The fi rst step, nitritation, is the oxidation of ammonia to nitrite (NH 4 + + 1.5 O 2 → NO 2 -+ H 2 O +

Récupéré en direct depuis OpenAlex et désinversé. Les résumés ne sont pas conservés dans cette base de données : les index inversés représentent 8,6 Go des 9,3 Go de texte de la base, et le serveur dispose de 13 Go libres.